题目：ABRE-BINDING FACTOR3-WRKY DNA-BINDING PROTEIN44 module promotes salinity-induced malate accumulation in pear

刊名：Plant Phyisol

作者：Ahmed Alabd, Yuanwen Tenget al.

单位：Zhejiang University, Hangzhou

日期：2023 Mar 18

01

摘要

苹果酸会影响水果的酸度，并在抗逆性方面起着至关重要的作用。作为应对压力的代谢产物，苹果酸积累是由各种植物中的盐度引起。然而，导致盐度诱导的苹果酸积累的确切分子机制仍不清楚。

在这里，我们确定与对照相比，盐度处理会诱导梨 (Pyrus spp.) 果实、愈伤组织和小植株中的苹果酸积累。遗传和生化分析确定了 PpWRKY44 和 ABRE-BINDING FACTOR3 (PpABF3) 转录因子在响应盐度促进苹果酸积累中的关键作用。

我们发现 PpWRKY44 通过直接结合苹果酸相关基因铝激活苹果酸转运蛋白 9 (PpALMT9) 启动子上的 W-box 来激活其表达，从而参与盐度诱导的苹果酸积累。一系列体内和体外试验表明，PpWRKY44 启动子中的 G-box 顺式元件被 PpABF3 靶向，进一步增强了盐度诱导的苹果酸积累。

总之，这些发现表明 PpWRKY44 和 PpABF3 在盐度诱导的梨苹果酸积累中发挥积极作用。这项研究提供了对盐度影响苹果酸积累和果实品质的分子机制的见解。

02

技术路线

梨愈伤组织来源于果实的果肉

梨愈伤组织的质粒构建及稳定转化

梨果实中基因的过度表达和病毒诱导的沉默

总RNA提取，RT-qPCR

苹果酸含量的测定

Y1H,LUC,EMSA

梨愈伤组织的GUS染色分析

梨愈伤组织的遗传转化

系统发育分析

03

主要结果

3.1盐度诱导梨苹果酸积累

为了测试盐度对梨中苹果酸积累的影响，用0、35和100 mM NaCl处理“hongzaosu”梨果实（图第1A段）。NaCl处理导致水果苹果酸水平显著增加（图1B）。液泡苹果酸通道PpALMT9的表达水平随着NaCl浓度从0增加到100 mM而显著增加，而液泡质子泵PpVHA-A、PpVHP1和PpVHP2以及液泡膜定位苹果酸转运蛋白PptDT的表达水平仅在100 mM NaCl下增加（图1C）。

为了验证盐度对苹果酸积累的影响，我们在含有0、35和100 mM NaCl的固体Murashige&Skoog（MS）培养基上处理梨愈伤组织，以模拟盐度胁迫（图1D）。盐度处理后，梨愈伤组织中苹果酸的含量显著增加（图1E）。RT-qPCR（逆转录定量PCR）分析显示，当盐度从0增加到100 mM时，盐度激活了苹果酸相关基因的表达水平，包括液泡质子泵PpVHP2和液泡膜定位的苹果酸转运蛋白PptDT，而液泡苹果酸通道PpALMT9仅在100 mM NaCl下增加（图1F）。利用梨植株进一步验证了盐度对苹果酸积累的影响（图1G）。盐度处理显著提高了梨植株的苹果酸水平（图1H）。这些结果证实，盐度诱导苹果酸在梨中积累。

图1：盐度诱导梨中苹果酸的积累。

A、 用不同浓度的NaCl（包括0、35和100mM）处理“hongzaosu”梨果实。

B，不同浓度NaCl下的苹果酸盐含量。

C、 不同浓度NaCl下苹果酸相关基因的RT-qPCR表达分析。

D、 用不同浓度的NaCl处理梨愈伤组织（包括0、35和100mM）。

F、 不同浓度NaCl下苹果酸相关基因的RT-qPCR表达分析。

G、 用不同浓度的NaCl处理梨植株。

3.2 PpWRKY44改善苹果酸盐对盐度的积累

在我们之前的研究中，我们鉴定了PpWRKY44，它被证明通过调节PpMYB10参与光诱导的花青素积累。PpWRKY44与PhPH3同源；据报道，后者可调节矮牵牛（petunia hybrida）的花瓣细胞酸度。系统发育分析和序列比对证实了PhPH3和PpWRKY44蛋白序列之间的密切关系。这一结果表明PpWRKY44可能与PhPH3具有相似的功能。

此外，为了初步研究PpWRKY44对盐度胁迫的反应，通过RT-qPCR检测了其在盐度处理的梨果实和愈伤组织中的表达水平。我们发现盐度增加了其表达水平（图2A）。然后，我们产生了PpWRKY44过表达的转基因梨愈伤组织（PpWRKY44 OX），并在PpWRKY44 OX愈伤组织中显示出较高的苹果酸水平。

此外，梨果实中短暂过表达的PpWRKY44显著增强了苹果酸的积累，而沉默PpWRKY44则损害了苹果酸产生。RT-qPCR分析显示，PpWRKY44OX中的PpALMT9表达显著高于EV愈伤组织。此外，RT-qPCR结果通过双荧光素酶测定得到证实。这些结果表明，PpWRKY44可能通过激活PpALMT9的表达来调节苹果酸的积累。为了研究PpWRKY44在苹果酸盐积累中对盐度的反应功能，用0 mM NaCl（0NaCl WT、0NaCl-PpWRKY44-OX和0NaCl-PpWRKY44-RNAi）和100 mM NaCl处理野生型（WT）和PpWRKY44转基因梨愈伤组织（PpWRKy44OX和PpWRKY44-RNAi）（图2B）。如图2C所示，在0 mM NaCl下，PpWRKY44 OX比WT积累更多的苹果酸，而PpWRKY44 RNAi积累更少的苹果酸。当用100mM NaCl处理梨愈伤组织时，PpWRKY44的过表达促进了盐度诱导的苹果酸积累。相反，PpWRKY44的沉默阻止了苹果酸积累的促进（图2C）。

RT-qPCR分析表明，PpALMT9在用0 mM或100 mM NaCl处理的PpWRKY44 OX梨愈伤组织中更高表达，而在用0 m M或100 m M NaCl处理过的PpWRKY44 RNAi转基因愈伤组织中，PpALMT9表达降低（图2D）。最后，这些结果表明，PpWRKY44改善了梨中苹果酸的积累，以响应盐度。

图2：对照品系和PpWRKY44转基因品系对盐度的反应表型和苹果酸含量。

A、 应用RT-qPCR对不同浓度NaCl处理下PpWRKY44在梨果实和愈伤组织中的表达进行分析。

B、 WT和转基因梨愈伤组织暴露于0 mM或100 mM NaCl 6小时的表型。

C、 暴露于0mM或100mM NaCl的WT和转基因梨愈伤组织中的苹果酸盐含量。

D、暴露于0mM或100mM NaCl的WT和转基因梨愈伤组织中PpWRKY44和PpALMT9的相对表达水平。

3.3 PpWRKY44直接与PpALMT9的启动子结合

由于PpALMT9的表达水平在PpWRKY44过表达的转基因愈伤组织中上调，我们认为该基因可能是PpWRKY44在苹果酸积累过程中调控的潜在靶基因。由于PpWRKY44似乎作为一种典型的WRKY TF与W盒结合，我们分析了PpALMT9的启动子序列，发现了几个W盒元件（图3A）。

为了确定PpWRKY44是否通过与其启动子结合来激活PpALMT9的转录，我们在本氏烟草叶片中进行了双荧光素酶测定。将PpWRKY44的编码序列插入pGreenII62SK中，并且含有PpALMT9的启动子片段的三个构建体（范围从大约PpWRKY44）直接与PpALMT的启动子结合，我们认为该基因可能是PpWRKY44在苹果酸积累过程中调控的潜在靶基因。由于PpWRKY44似乎作为一种典型的WRKY TF与W盒结合，我们分析了PpALMT9的启动子序列，发现了几个W盒元件（图3A）。

为了确定PpWRKY44是否通过与其启动子结合来激活PpALMT9的转录，我们在本氏烟草叶片中进行了双荧光素酶测定。将PpWRKY44的编码序列插入pGreenII62 SK中，构建三个包含约1.0 kb至约0.4 kb的PpALMT9启动子片段的构建体，并将其克隆到pGreenII 0800-LUC中（图3A）。如图3B所示，双荧光素酶测定显示，PpWRKY44的靶基序位于-563bp至-1003bp之间的区域，在该区域鉴定出三个W-box基序。对于Y1H测定，我们首先构建了PpALMT9启动子片段P1（−365至−675 bp）和P2（−628 bp至−989 bp）。将这两个片段融合到pAbAi载体中（图3C）。在酵母单杂交试验中，与pAbAi-PpALMT9-P2和pGADT7-pWRKY44共转化的酵母细胞可以在含有AbA的SD/-Leu培养基上生长，但与pAbAi-PpALMT9-P1和pGADT7-pWRky44共转化后的酵母细胞不生长（图3C）。

为了进一步验证PpWRKY44和PpALMT9启动子之间的相互作用，我们使用PpWRKY44 GFP蛋白进行了染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR测定。结果表明，PpWRKY44富集了P2启动子片段，但不富集P1（图3D）。综合考虑，结果表明PpWRKY44通过直接调节启动子PpALMT9基因来促进苹果酸的积累。

图3:PpWRKY44直接与PpALMT9的启动子结合。

A、 潜在PpWRKY44结合位点在PpALMT9启动子区的分布。

B、 PpWRKY44对PpALMT9启动子的一系列片段的反式激活作用。

C、 PpALMT9启动子片段P1（−365至−675 bp）和P2（−628 bp至−989 bp）以及酵母细胞中PpWRKY44和这些片段之间的相互作用图。

D、 PpWRKY44与PpALMT9启动子结合的ChIP-qPCR测定。来自GFP和PpWRKY44GFP梨愈伤组织的染色质用或不用GFP抗体进行免疫沉淀。将GFP的富集度设置为1。

3.4 aPpABF3与PpWRKY44启动子结合

为了更好地了解盐度如何调节PpWRKY44的表达，我们使用了PlantCARE数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)并在PpWRKY44启动子序列中搜索顺式作用元件。有趣的是，我们发现G-box基序位于转录起始位点上游132-127bp（图4A），适合结合ABRE结合因子（ABFs）。

先前的研究表明，ABF3的表达可以由盐度诱导（Yoshida等人，2010；Wang等人，2016a）。因此，我们假设PpABF3参与PpWRKY44对盐度的转录调控。表达分析显示，盐度处理后，PpABF3的表达增加（图S6）。然后，我们进行了Y1H测定，以测试PpABF3是否可以与PpWRKY44的启动子结合。结果表明，与pAbAi-PpWRKY44和pGADT7-pABF3共转化的酵母细胞可以在含有AbA的SD/-Leu培养基上生长，但与pAbAi-PpWRKY44和pGADT7共转化的阴性对照不生长（图4B）。

此外，使用重组PpABF3-HIS融合蛋白进行EMSA。结果表明，当将PpABF3蛋白与含有源自PpWRKY44启动子的G-box基序的生物素标记探针混合时，蛋白-DNA复合物减少了迁移。通过添加浓度增加的未标记探针，蛋白质-DNA复合物的形成减少，表明存在结合竞争。当添加突变探针时，PpABF3蛋白没有形成蛋白-DNA复合物（图4C）。

接下来，我们在N.benthamiana叶片中进行了双荧光素酶测定，以进一步证实PpWRKY44启动子上的PpABF3调节。将PpWRKY44的启动子克隆到pGreenII0800-LUC载体中以产生报告构建体，同时将PpABF3的编码序列插入pGreenII62SK载体中以生成效应构建体。N.benthamiana叶片与含有构建的载体的农杆菌菌株共同渗透。如图4D所示，PpABF3激活了PpWRKY44启动子的表达。

然后，我们使用GUS测定来验证PpABF3对PpWRKY44的激活。将重组质粒ProPpWRKY44GUS转化为PpABF3过表达的梨愈伤组织。GUS染色显示，与对照相比，PpABF3增强了梨愈伤组织的GUS染色（图S7）。总之，PpABF3直接与PpWRKY44启动子结合以激活其表达。

图4:PpABF3直接与PpWRKY44的启动子结合。

A、 显示潜在PpABF3结合位点的PpWRKY44启动子的示意图。

B、 进行Y1H分析以检测PpABF3-TF和PpWRKY44启动子之间的相互作用。

C、 EMSA显示PpABF3融合蛋白与PpWRKY44启动子的G-box结合。

D、 PpABF3在双荧光素酶测定中诱导PpWRKY44转录。

3.5PpABF3通过激活PpWRKY44的表达促进苹果酸的积累

鉴于观察到PpABF3激活PpWRKY44的启动子（图4），我们假设PpABF3在调节苹果酸积累中发挥作用。为了测试这一点，我们产生了过表达PpABF3的转基因梨愈伤组织（PpABF3-OX），并在PpABF2-OX愈伤组织中显示出较高的苹果酸水平。此外，梨果实中短暂过表达的PpABF3显著增强了苹果酸的积累，而沉默PpABF3削弱了苹果酸产生。此外，进行RT-qPCR分析以检查PpWRKY44和PpWRKY44靶向基因在转基因愈伤组织系中的表达。结果表明，PpABF3的过表达上调了PpWRKY44及其靶基因PpALMT9的表达。

为了验证PpABF3在响应盐度的苹果酸积累中的功能，用0mM NaCl（0NaCl WT、0NaCl-PpABF3-OX和0NaCl-PpABF3-RNAi）和100mM NaCl（100NaCl WT、100NaCl-ABF3-OX和100NaCl-Pp ABF3-RNAi）处理野生型（WT）和PpABF3-转基因梨愈伤组织。如图5B所示，在0 mM NaCl下，PpABF3-OX比WT积累更多的苹果酸，而PpABF3 RNAi积累更少的苹果酸。当梨愈伤组织用100mM NaCl处理时，PpABF3的过表达促进了盐度诱导的苹果酸积累。相反，PpABF3的沉默阻止了苹果酸积累的促进（图5B）。RT-qPCR分析表明，PpWRKY44和PpALMT9在用0 mM或100 mM NaCl处理的PpABF3-OX梨愈伤组织中更高表达，而PpWRKY44和PpALMT9在使用0 mM和100 mM氯化钠处理的Pp ABF3-RNAi转基因愈伤组织中表达减少（图5C）。总之，这些结果表明，PpABF3通过调节PpWRKY44的表达来改善苹果酸盐的积累，从而增强PpALMT9的表达。

图5:PpABF3调节苹果酸的积累以响应盐度。

A、 WT和转基因梨愈伤组织暴露于0 mM或100 mM NaCl 6小时的表型。

B、暴露于0mM或100mM NaCl的WT和转基因梨愈伤组织中的苹果酸盐含量。

C、 暴露于0mM或100mM NaCl的WT和转基因梨愈伤组织中PpABF3、PpWRKY44和PpALMT9的相对转录水平。

3.6PpWRKY44是PpABF3调节苹果酸积累以响应盐度所必需的

为了探索PpWRKY44在PpABF3调节的苹果酸积累中的功能，以空载体为对照，将这些构建体（包括PpWRKY44 OX、PpABF3-OX、PpWRky 44 TRV、PpAFF3 TRV）以及双组合PpWRKY44 OX+PpABF3 OX和PpWR京都44 TRV+PpABF3-TRV）分别渗透到梨愈伤组织中。PpWRKY44 OX比空载体具有更高的苹果酸含量，这与PpABF3 OX一致，并且PpWRKY44 OX+PpABF3 OX双渗透梨愈伤组织比单独的PpWRKY44 OX或PpABF3-OX产生更高的预期苹果酸含量。

PpWRKY44 TRV或PpABF3 TRV渗透的梨愈伤组织的苹果酸含量低于TRV对照，而PpWRKY44 TRV+PpABF3-TRV双重渗透的梨愈伤组织的苹果酸水平低于单独的PpWRKY44 TRV和PpABF2-TRV。与对照相比，PpALMT9在PpWRKY44 OX、PpABF3 OX和PpWRKY44 OX+PpABF3 OX样品中表现出增加的表达水平，而在PpWRKY44 TRV、PpABF3 TRV和PpWRKY44 TRV+PpABF3-TRV样品中降低。

为了进一步阐明PpABF3通过调节PpWRKY44的表达来增加苹果酸的积累，以空载体为对照，将三种构建体，包括PpABF3-OX、PpABF2-OX+PpWRKY44-OX和PpABF4-OX+PpWRKY44-TRV，分别渗透到梨愈伤组织中（图6A）。PpABF3-OX+PpWRKY44-OX渗透的梨愈伤组织比单独的PpABF3-OX产生更高的苹果酸含量，而PpABF2-OX+PPWRKY44TRV渗透的梨calli比单独的PpABF3-OX产生更低的苹果酸浓度（图6B）。作为对PpWRKY44过度表达的反应，PpWRKY44和PpALMT9的表达水平增加。相比之下，这些基因的表达因PpWRKY44的抑制而降低（图6C）。总之，这些结果进一步证明，PpWRKY44是PpABF3调节苹果酸积累以响应盐度所必需的。

图6:PpWRKY44是PpABF3调节苹果酸积累以响应盐度所必需的。

A、 梨愈伤组织的表型用EV、PpABF3-OX、PpABF3-OX+PpWRKY44-OX和PpABF3 OX+PpwrKY44TRV瞬时渗透）对盐度的响应。

B、 暴露于100mM NaCl的EV和转基因梨愈伤组织中的苹果酸盐含量。

C、 暴露于100mM NaCl的WT和转基因梨愈伤组织中PpABF3、PpWRKY44和PpALMT9的相对转录水平。

04

结论

基于这项工作中的发现，我们提出了PpWRKY44和PpABF3调节苹果酸积累以响应盐度的功能的工作模型（图7）。在该模型中，PpABF3直接调节PpWRKY44的启动子，并促进苹果酸的积累以响应盐度。此外，PpWRKY44直接与PpALMT9启动子上的W-box结合，并增强其表达。PpALMT9活性的增强将增加苹果酸从细胞质到液泡的运输，导致苹果酸在液泡中大量积累。我们的发现为盐度影响苹果酸积累的分子机制提供了见解。这些发现为培育风味优良的梨新品种提供了一种潜在的生物技术策略。

图7：一个工作模型表明，PpABF3与PpWRKY44的启动子相互作用，并增强其对下游靶基因PpALMT9的活性，导致苹果酸含量增加以响应盐度

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原文获取

原文链接：

https://academic.oup.com/plphys/advance-article-abstract/doi/10.1093/plphys/kiad168/7080284?redirectedFrom=fulltext&login=false

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https://www.scientsgene.com/h-nd-178.html

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