设计引物流程（以Primer Premier 5为例）：

查找基因cDNA/mRNA序列(物种名+基因名)

【如图示，选Nucleotide，搜索框中输入基因名和物种名（拉丁学名），点击搜索】

注：一般很难直接搜到该物种的目的基因，可以尝试着先搜到与该物种亲缘关系相近的目的基因，下载该序列，利用NCBI上的BLAST工具进行序列比对。

获得基因序列后，打开primer 5.0

注：S是上游引物，A是下游引物，sense，anti-sense最好都是None，再细看

ΔG绝对值小于10

tm在60左右，正负1度 

GC%在40%-60%

末端不能是A

不能有连续3个相同的碱基

3’端一定不能有错配

5端不要是G

【筛选原则】：

1. 最好hairpin, dimer, false priming 没有 2. 最好是没有连续相同碱基，如TTT、GGG 3. 最好两个引物之间bp之差小于等于2， 4. 产物长度大于100，小于300最好，也可以到400 5. tm在58左右，正负2度 6.一般设计时引物18-22长度，最长不要超过25 7.3’不能以A结尾 8.出现Found时，ΔG绝对值小于10

注：由于基因序列本身的差异，一般很难调到所有原则都满足，但是可以对系统给出的引物中的前几对进行调整，尽可能满足以上原则。

【如何调整】：

以系统给出的第一对引物为例（看框住的地方），虽然系统给出的评分比较高，但是下游引物可能出现发夹结构（Hairpin）和二聚体（Dimer）,我们可以尝试调整一下。

首先点击左上角的A（Anti-sense），当图示的引物与A的颜色一直时，表示展示的是Anti-sense，然后把鼠标的光标放在引物的位置左右滑动，调整上下游引物位置。

点击3“端，序列的位置会跟着移动，点击之后，序列会变成默认长度，如果需要更改默认长度，点击左上角File>preference 

根据Tm值和GC含量等调整引物长度在合适范围即可

注意编辑引物时，只能从右边添加或删除碱基，如果想在左边添加或删除需要通过左右移动碱基的位置。有时候评分不错的上下游引物也可以调整，以下图为例，我想删掉5’端的一个C，降低GC含量

5' CACTGACTGCCAGAAGACC 3'

5' TACTCGTTCCAGGACCACC 3'

【如何导出？先打开一个Excel文件】

总结：根据系统给出的评分，看前几对引物是否是理想的引物，大部分情况不会都满足上述原则，需对前几对进行调整。（三步结合使用）

一：删除或添加末端碱基

二：拖动碱基的位置，向前移动一个或多个碱基或向后移动一个或多个碱基

三：点击Edit Primers，删除几个碱基后分析