DNA作为遗传信息的携带者和基因表达的物质基础，在生物体的生长、发育、衰老、遗传和变异等生命过程中起着极为重要的作用。目前测定DNA的分析方法有很多种，其中荧光探针技术是一种借助高灵敏度光学检测设备在分子水平上进行实时监测的重要技术手段，具有操作简单、灵敏度高、选择性好、可视性强、适应环境能力强等特点，在生物学分析中受到了人们的广泛关注和研究。荧光标记DNA片段包括荧光标记寡核苷酸探针和荧光标记长片段DNA探针。近年来，用荧光染料对探针进行非放射性标记受到很大重视，并取得了迅速发展，广泛应用于核酸序列测定、基因检测以及疾病诊断等。

一、 什么是荧光

当紫外光或可见光照射到某些物质上的时候，这些物质就会发射出波长和强度各不相同的光线，而当紫外光或可见光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。

荧光的波长比吸收的紫外线的波长要长些。荧光产生的过程简单来说，是物质在吸收入射光的过程中，光子的能量传递给物质分子，分子被激发，处于激发态的分子不稳定，可通过辐射跃迁的衰变过程而返回基态，衰变过程伴随着光子的发射，即产生荧光。一些能产生荧光的物质可以运用到生物染色剂中，我们称之为荧光染料（荧光色素）或荧光探针。

二、荧光淬灭

荧光淬灭一般是指荧光分子通过与溶剂或者与之对应的溶质分子之间的物理或者化学作用从而降低荧光强度的过程。在这个过程中，发光分子的基态寿命会产生一定程度的缩短。

荧光淬灭一般有动态淬灭和静态淬灭两类。这些能使荧光发生淬灭的物质被称作荧光淬灭剂，而荧光淬灭使得荧光物质的荧光量子产率大幅度降低。荧光淬灭还表现在分子受阻碰撞淬灭，自身能量的消失或者转移，外力阻止的淬灭等。

三、荧光标记寡核苷酸的应用

荧光标记寡核苷酸的应用基础是核酸杂交原理。通过与目标核酸分子进行各种形式的杂交反应，再采用相关的荧光探针检测技术，对靶DNA或RNA进行分析。在与修饰寡核苷酸应用相关的诊断测试手段中，荧光检测（如基于荧光探针的qPCR）是极其重要的一类技术。对例如DNA Sanger测序和原位杂交（如FISH）的某些特定应用，寡核苷酸需要单一标记，而用于DNA/RNA实时荧光定量检测的探针（荧光基团-淬灭剂探针）和用于等位基因鉴别的探针（分子信标），均为双重标记，即使用荧光基团—淬灭剂对，动态淬灭通过FRET（荧光共振能量转移）或碰撞淬灭发生。淬灭机制与探针类型有关，一般来说，要么探针打开，增加荧光基团与淬灭剂之间的距离使淬灭停止（分子信标），要么荧光基团或淬灭剂从探针（Taqman探针）上裂解（最常见）。

四、荧光基团

1、荧光素标记

寡核苷酸标记荧光素类染料的方法有多种，且标记的选择多样化，跟芳香环的氯化程度有关——这决定了染料的荧光发射。衍生自单异构体6-羧基荧光素的6-FAM CE Phosphoramidite、6-HEX CE Phosphoramidite和6-TET-CE Phosphoramidite均可用于寡核苷酸5’端的有效标记。

另外两种可用于寡核苷酸荧光素标记的亚磷酰胺单体：6-Fluorescein-CE Phosphoramidite和Fluorescein-CE Phosphoramidite，这两种单体都包含与6-FAM CE Phosphoramidite相同的荧光染料，但链接骨架不同。6-Fluorescein-CE Phosphoramidite具有1,3二醇结构，其中额外的OH受DMTr保护。这样不但可以通过DMTr的释放监测偶联效率，而且还可以在寡核苷酸中进行多次添加，可用于染色体涂染等。然而，这通常需要在每次添加之间加入一个接头（例如spacer-18），防止荧光素自淬灭。Fluorescein-CE Phosphoramidite提供了与6-Fluorescein-CE Phosphoramidite相同的可能性，但该种情况下接头通过硫脲键连接至荧光素。

序列内部添加荧光素可通过使用Fluorescein-dT-CE Phosphoramidite取代任意适合的dT残基实现。同样可以进行多次添加，但每个fluorescein-dT之间的间距对防止自淬灭至关重要。

寡核苷酸3’端荧光素的标记可通过使用四种不同载体实现。基于取代荧光素5-异构体的3’-Fluorescein CPG以及由6-FAM制备的3'-(6-Fluorescein) CPG，通常均用于此目的。此外，还有同样源自6-羧基荧光素的3'-(6-FAM) CPG和Fluorescein-dT CPG；其中3'-(6-FAM) CPG可以有效阻断聚合酶向3’末端的延伸以及核酸外切酶活性。

2、菁染料Cyanine dyes（包括QuasarTM染料）

菁染料作为荧光标记的寡核苷酸主要用于分子诊断中的探针制备，例如real-time PCR、荧光原位杂交（FISH）、以及基于表面增强共振拉曼光谱（SERRS）的DNA检测。它们的发射光谱可以通过改变聚甲炔链的长度来调节，并且可以通过芳环上的取代基来改变它们在有机或水性溶剂中的溶解度。

最常用的亚磷酰胺染料是Cyanine-3 (Cy3 MMTr CE Phosphoramidite)和Cyanine-5 (Cy5 MMTr CE Phosphoramidite)。这些染料通常在合成过程中连接到寡核苷酸的5'端，但也很容易掺入序列中间。羟基保护基MMT的去除方式与DMTr保护基相同。由于结构中缺少杂环碱基，掺入序列中间并不常见，而且不具备参与碱基配对的能力——会使形成的双链不稳定。

对于3'-修饰，可引入等效的3'-修饰1000 Å CPG载体，3'-Cyanine-3 (3'-Cyanine-3 CPG) 和3'-Cyanine-5 (3'-Cyanine-5 CPG)。

Quasar染料570和670（亚磷酰胺单体）是荧光吲哚羰菁，分别在橙黄色和红色区域发出荧光的可见光谱。这两种染料在荧光探针标记中的应用直接同功于常见的菁染料（Cy™），Quasar570类似Cyanine-3/Cy3，Quasar670类似Cyanine-5/Cy5。与Cyanine-3和Cyanine-5不同的是Quasar染料不能在寡核苷酸序列中间添加。

3、CAL FluorTM染料

CAL Fluor染料是一组专门为qPCR仪器设计的荧光染料。这些新型的呫吨荧光基团可以替代以前的染料，是低成本的替代品。染料可以高效制造，并且在寡核苷酸的合成及后处理条件下保持稳定。将CAL Fluor染料与生物分子连接的连接化学消除了多种异构体的问题。这使得染料标记更易于制备、具有单个RP-HPLC峰并具有明确的发射光谱。

CAL Fluor染料可以CPG和亚磷酰胺单体的形式提供，最大发射波长为520nm至635nm，可与淬灭基团BHQ-1或BHQ-2配对。

4、ROX染料标记

ROX荧光染料（羧基-X-罗丹明）通常用作被动参比染料，为荧光报告染料（即多重qPCR或real-time PCR中的SYBR Green I或TaqMan探针）提供稳定的基线。基线还允许校正移液误差、荧光波动和仪器漂移，例如灯强度输出随时间的变化。由于染料不会干扰qPCR扩增，因此将恒定量添加到所有样品中作为对照。

根据实验期间使用的滤光镜和real-time PCR仪器，可能需要调整ROX的浓度。早期的real-time PCR仪器没有匹配ROX的滤光镜，因此需要高浓度来建立基线。后来的仪器使用内标解决了这一短板，以校正光强度。由于ROX染料与所有PCR仪器兼容，现在的仪器已针对ROX光谱设置进行校准，因此无需重新校准热循环仪。

表1：染料/淬灭剂选择表

（染料按吸光度最大值的顺序列出；色标仅用作图形表示）

五、淬灭基团

1、TAMRA标记

TAMRA是寡核苷酸的应用中最常用的罗丹明染料。其荧光特性有时用于寡核苷酸标记，但TAMRA更常用作淬灭剂。

TAMRA的光吸收特性以及与几种常用荧光团（包括FAM、HEX、TET和JOE）的光谱重叠，使其可用作设计双标探针的淬灭剂。然而，TAMRA的用处有限，因为它的发射光谱广，这降低了它在多重检测中应用的能力。其固有荧光产生背景信号，会潜在降低基于TAMRA检测的灵敏度。尽管存在这些限制，TAMRA已广泛用于检测探针的设计，尤其是用于Real-Time PCR的Taqman探针。

寡核苷酸可以使用两种不同的方法标记TAMRA。TAMRA对强碱不够稳定，且在氢氧化铵存在下降解。如果需要去保护，则在寡核苷酸的3'-（最常见）或5'-末端合成氨基，并使用TAMRA-NHS酯进行合成后标记TAMRA。使用温和的去保护单体合成的寡核苷酸可以直接用TAMRA标记，或者在序列中间通过用TAMRA-dT-CE Phosphoramidite (LK2143) 取代任何合适的dT残基，或者在3'-末端使用3'-TAMRA CPG载体 (LK2434)。随后寡核苷酸的脱保护在70˚C下使用叔丁胺/甲醇/水（1:1:2）处理2.5小时完成。尽管仍有少量TAMRA降解，但在纯化过程中很容易去除。如前所述，TAMRA也是一种荧光基团，虽然是使用最广泛的淬灭剂之一，但应用中通常需要使用黑暗淬灭剂（Dark Quencher）。

2、非荧光淬灭剂

2.1 Dabcyl标记

Dabcyl由于其吸光特性且无残留荧光，已被广泛用作诊断探针（如分子信标）中的淬灭剂。在非活性状态下，分子信标不与靶序列杂交，荧光基团的荧光能量通过碰撞淬灭过程转移至淬灭剂。为了有效地进行光能转移，荧光基团和淬灭剂必须非常靠近。分子信标的设计中考虑了这一要求，因为茎的两部分杂交以保持F/Q非常靠近的距离。分子信标探针与其靶序列的杂交导致茎的分离，从而导致F/Q对的分离，产生荧光。

由于Dabcyl对寡核苷酸合成过程稳定，它可以通过修饰子的形式掺入序列中的任何位置：在5'端使用5'-Dabcyl-CE Phosphoramidite——例如在TwistAmp fpg探针上的使用；在3'端使用3'-Dabcyl CPG——例如用于Taqman探针、蝎形引物和分子信标；或在序列中间使用Dabcyl-dT-CE Phosphoramidite——例如在蝎形引物中。

Dabcyl的吸收特性将其可淬灭的染料范围限制为发射波长为400-550nm（最大吸收波长为471nm）的染料。然而，当在分子信标中使用时，Dabcyl和荧光基团足够接近，进而可以淬灭稍宽光谱的染料，从而增加了Dabcyl分子的通用性。

Dabcyl在大多数情况下已被BHQ系列染料取代。

2.2 黑洞淬灭剂

现代基因组和诊断应用的需求通常集中在对更高检测灵敏度的日益增长的需求上，这导致了一系列新的非荧光淬灭剂的开发。其中最著名的是Black Hole Quencher™试剂（BHQ试剂），它专门针对基于FRET的淬灭进行了优化。

由于每种BHQ染料具有高消光系数和宽光谱重叠，因此与Dabcyl等分子相比，淬灭效率有所提高。这意味着BHQ染料为不同检测目的提供了更大范围波长的使用，覆盖可见光到近红外区域（480-730nm）。再加上这些分子没有残留背景荧光（是真正的暗淬灭剂），使BHQ染料成为real-time PCR应用的有利选择。

在四种BHQ淬灭剂中，BHQ-1和BHQ-2更受欢迎，无论5’-Phosphoramidites (LK2154和LK2155)、dT-Phosphoramidites (LK2156和LK2157)，或是3’-CPG (LK2379和LK2380)。如果仅考虑激发和发射值，Cy5、Cyanine-5和Quasar 670需要BHQ-3才能有效淬火，但建议使用BHQ-2，因为它不易降解。BHQ-1通常用于在480-580nm范围内的淬灭，可与常用荧光基团配合使用，如FAM、TET、JOE和HEX。BHQ-2用于在550-650nm范围内的淬灭，淬灭TAMRA、ROX、Cyanine-3、Cy3、Cy3.5™和Red 640等荧光基团最为有效。每种BHQ亚磷酰胺和CPG均可直接用于自动化合成。