技术领域

本发明涉及体液样本的分析检测领域，具体涉及制备一种羟基磷灰石（HAP）纳米粒子负载金属纳米粒子复合材料，以该纳米复合材料为SERS底物，结合表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy，简称SERS），对不同人群中采集的体液样本进行光谱检测。

背景技术

近年来，拉曼光谱在生物医学、食品安全、材料科学和环境监测中的应用引起了人们的广泛关注。拉曼光谱是由印度科学家拉曼在1928年发现的一种分子振动光谱技术。它可以根据生物组织的分子组成和结构提供光谱指纹类型信息。与红外吸收光谱和荧光光谱相比，拉曼光谱具有空间分辨率高、峰窄、不发生光漂白等显著优势。然而拉曼光谱信号微弱，易受自体荧光干扰，低效率的散射需要高的激光功率，光谱采集时间长，因此可能导致样品损坏或在实际应用中不切实际，所以利用拉曼光谱技术进行检测存在一定局限性。SERS技术被认为是一种用于生物医学检测的高度灵敏的分析技术，SERS技术具有超高的灵敏度、快速响应时间和分子振动指纹生成能力，并且能淬灭生物分子荧光，解决了普通拉曼光谱信号微弱的问题，将原有的拉曼信号大大提高10

由于SERS具有优异的分子特异性和高灵敏度，能够快速、无损、超灵敏检测分析复杂的生物分子，例如血浆、血清、尿液、唾液、细胞、组织、DNA、RNA等。近年来许多研究人员将SERS用于肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌等样本的检测。

银（Ag）是一种常见的贵金属，相比其他贵金属如金、钯和铂等具有廉价的优势。银纳米材料通常具有非常稳定的物化性质，目前银纳米颗粒已经在SERS、催化和硫化物检测等领域获得了广泛的应用，但是纳米颗粒尺寸的减小伴随着表面能的增加，高表面能会使纳米颗粒之间发生团聚，为了提高纳米颗粒的稳定性，通常需要将其负载到一些载体材料表面制得纳米颗粒复合材料。羟基磷灰石HAP由于具有高生物相容性和骨传导特性，因此是一种广泛使用的生物医学材料，它们还被用于分离和吸附领域。由于它们基于磷酸钙中含有丰富的Ca

发明内容

本发明目的在于提出一种利用SERS技术检测体液样本表面增强拉曼光谱的方法。构建HAP/Ag基底，直接将被检测物滴加到基底上,通过SERS技术实现对样本的快速检测。相比于传统检测方法,该检测方法避免了繁琐的样品前处理过程，具有快速、操作简单、成本低廉等特点，极大缩短了时间，提高了检测效率。该方法中主要用到的纳米材料是HAP，HAP具有高骨传导，骨诱导性，生物相容性好，本发明采用水热法制备花瓣状HAP。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于HAP/Ag对体液样本表面增强拉曼光谱的检测方法，将银纳米粒子沉积在HAP上制备成复合SERS增强基底，通过SERS技术进行检测不同人群中采集的体液样本，实验证明HAP/Ag复合SERS增强基底可以有效检测体液样本。

进一步地讲，该方法包括以下步骤:

1、HAP的制备

采用水热法制备HAP纳米颗粒，称取1-1.5 g的Ca(NO

2、HAP/Ag的制备

称取3-7 mg干燥好的HAP粉末加入到装有15 mL,20 mM的硝酸银的乙醇溶液，超声25-50 min使其均匀分散。然后将上述悬浊液置于30-50℃ 水浴加热的环境中，向其中加入15-30 µL的正丁胺，磁力搅拌30-50 min。待反应结束后，将反应产物离心分离，水洗两次，无水乙醇洗两次，最后放于30-50℃真空干燥箱中干燥24-48 h得到最终产物。将制备好的HAP/Ag涂抹到铝片上作为SERS增强基底。

3、HAP/Ag的SERS检测

分别用不同人群的体液样本作为底物进行SERS测量，在SERS实验中，将不同体液样本滴加到HAP/Ag复合SERS增强基底上。在空气中自然风干，用于SERS测量。采用400-850nm的激光光源照射上述样本，拉曼光谱取谱范围为400-1800 cm

4、得到不同体液样本的SERS特征峰

不同体液样本重复步骤（1）到（3）的操作建立不同体液样本表面增强拉曼光谱数据库，采用扣荧光的方法对所述表面增强拉曼光谱数据库进行后处理分析，建立表面增强拉曼光谱分析模型，获得不同体液样本对应的表面增强拉曼光谱的特征峰。

其中，所述不同体液样本使用量的体积为50-200 µL。

其中，所述的不同人群中采集的体液样本是指血清、尿液、唾液。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、将银纳米粒子沉积在HAP上制备成复合SERS增强基底，样品滴加到上面可直接进行SERS检测。

2、无需复杂的预处理步骤，操作简单，耗时短。

3、不受样品条件限制，几乎可对任何人群的体液样本进行鉴定。

附图说明

图1是本发明方法的检测流程图。如图所示，本发明将银纳米粒子沉积在HAP上制备成复合SERS增强基底，再将不同人群中采集的体液样本直接滴加在上面，通过SERS技术进行检测。

图2是本发明证明HAP/Ag具有增强基底的作用的SERS光谱图。

图3是本发明将血清滴加到HAP/Ag复合SERS增强基底上测量的SERS光谱图。

图4是本发明将尿液滴加到HAP/Ag复合SERS增强基底上测量的SERS光谱图。

图5是本发明将唾液滴加到HAP/Ag复合SERS增强基底上测量的SERS光谱图。

图6是制备的HAP/Ag复合物的扫描电镜图(SEM)，放大倍数为10000倍，粒子为上面附着小颗粒、边缘粗糙的花瓣状。

具体实施方式

下面对本发明的方案措施作进一步的说明。

实施例1

羟基磷灰石HAP的制备

称取1-1.5 g Ca(NO

实施例2

HAP/Ag的制备

称取3-7 mg干燥好的HAP粉末加入到装有15 mL, 20 mM硝酸银的乙醇溶液，超声25-50 min使其均匀分散；然后将上述悬浊液置于30-50℃水浴加热的环境中，向其中加入15-30 µL的正丁胺，磁力搅拌30-50 min；待反应结束后，将反应产物离心分离，水洗两次，无水乙醇洗两次，最后真空干燥放于得到HAP/Ag纳米颗粒；将制备好的HAP/Ag涂抹到铝片上作为SERS增强基底。

实施例3

基于HAP/Ag 基底滴加上R6G，证明其具有增强基底的作用

首先配制好浓度为10

实施例4

基于HAP/Ag 基底滴加上血清的SERS检测

称取HAP/Ag粉末3-9 mg加入到1.5mL容积的聚丙烯离心管中，在离心管中加入50-100 µL蒸馏水，超声分散10-30 min，将分散后的HAP/Ag涂抹于纯度为99.99%铝片上，取50µL的血清滴加到HAP/Ag 基底上，室温下晾干，进行SERS光谱检测。检测所用激光激发波长为785 nm，取谱范围为400-1800 cm

实施例5

基于HAP/Ag 基底滴加上尿液的SERS检测

HAP/Ag 复合SERS增强基底滴加上尿液的表面增强拉曼光谱检测的方法和实施例1的过程相同。取200 µL尿液滴加到HAP/Ag 基底上，室温下晾干，进行SERS光谱检测。检测所用激光激发波长为785 nm，取谱范围为400-1800 cm

实施例6

基于HAP/Ag 基底滴加上唾液的SERS检测

HAP/Ag 复合SERS增强基底滴加上唾液的表面增强拉曼光谱检测的方法和实施例1、2的过程相同。取100 µL唾液滴加到HAP/Ag 基底上，室温下晾干，进行SERS光谱检测。检测所用激光激发波长为785 nm，取谱范围为400-1800 cm