单克隆抗体是由单一 B 细胞克隆产生的、仅与某一特定靶抗原结合的抗体。其作用原理是刺激患者的免疫系统，调节或抑制某些生化疾病途径，或向靶细胞输送放射性核苷酸或药物。治疗性单克隆抗体的特异性远高于小分子药物，这可将副作用降至最低，特别是当必须输送剧毒药物时。

在过去十年里，单克隆抗体疗法的市场份额迅速增加，2019 年，十大畅销药物中有六种是单克隆抗体。类风湿性关节炎药物修美乐的销售额超过 190 亿美元，而作为多种免疫疗法策略之一的癌症药物健痊得的销售额超过 110 亿美元[1]。2020 年，美国市场上大约有 100 种治疗性单克隆抗体，还有更多在开发和试验中。

寻找有效疗法可能要花费大量时间和资金；一项针对 2009 至 2018 年间美国食品药品监督管理局批准的 63 种药物和生物制剂的研究表明，每种产品的资本化研发成本中位数约为 9.85 亿美元[2]。

从选择靶抗原背后的基础研究，到各种可用的抗体产生方法、表征策略和商业化生产，需要考虑许多因素。本文介绍了治疗性单克隆抗体开发中的关键主题。

自从 1975 年 Köhler 和 Milstein 创建杂交瘤技术以来[3]，单克隆抗体产生技术经过发展，现有方法包括使用转基因动物产生全人单克隆抗体[4,5]、抗体噬菌体展示[6]和单个 B 细胞分离后克隆生产[7]。

较新的技术使用分子生物学技术，通过 PCR 扩增抗体基因，通过重组技术在细菌或哺乳动物表达系统中产生单克隆抗体。

B 细胞杂交瘤是一种体细胞杂交产物，可生产大量单克隆抗体。要产生杂交瘤，首先给小鼠注射一种能引发免疫应答的抗原。下一步是收获产生与抗原结合的抗体的 B 细胞。然后，这些 B 细胞与一个骨髓瘤细胞（永生 B 细胞癌细胞）融合，该骨髓瘤细胞的细胞系已无法产生免疫球蛋白但仍能无限增殖。所得杂交瘤细胞系既有骨髓瘤的存活力和繁殖能力，又有 B 细胞的抗体产生能力。杂交瘤可以在细胞培养中繁殖，产生大量的抗体分子，这些分子都与同一抗原结合。

由杂交瘤产生的鼠单克隆抗体具有高特异性，但不一定触发人类效应物功能（例如，补体系统）。患者免疫系统将其识别为外源蛋白，刺激人抗鼠抗体的产生（HAMA 反应）[8]，并导致血清半衰期缩短，这可能会限制它们的治疗用途并可能导致过敏反应。

转基因小鼠品系的创造是治疗性单克隆抗体生产的一个突破，该品系旨在产生人类抗体而不是小鼠抗体。这种小鼠的产生方法是将人免疫球蛋白基因座的基因片段导入由于靶基因缺失而导致小鼠抗体生产不足的小鼠种系。如果免疫，这些动物会产生抗原特异性的全人单克隆抗体。

通过互补决定区（CDR）移植技术产生人源化抗体[9]加速了治疗性单克隆抗体的批准。在 CDR 移植中，将负责抗原结合的 CDR 环移植到人类可变域框架序列中，保持其靶特异性，但避免触发免疫应答。

分子和细胞免疫学的进步使研究人员能够操控转基因动物的免疫系统，从而产生更大的人类抗体库。随着新一代测序（NGS）的出现，现在有可能确定构成完整动物抗体库的序列，增加我们对影响它的方式的理解。

人类单克隆抗体和人源化单克隆抗体是主要的治疗性单克隆抗体；临床使用的所有单克隆抗体中，人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体和鼠抗体的比例分别为 51%、34.7%、12.5% 和 2.8%[10]。

抗体噬菌体展示文库[11]可使用幼畜或免疫动物的杂交瘤或 B 细胞的完整免疫库创建，也可以合成构建。为了创建噬菌体展示文库，将给抗体片段编码的 DNA 序列拼接到丝状噬菌体的外壳蛋白基因中，使噬菌体在其表面表达或"展示"所得融合蛋白。表面展示的肽序列表型（特异性和敏感性）与工程噬菌体基因组的基因型序列相关。这一过程产生的组合文库提供了一种从数百万个不同片段的文库中鉴定靶结合抗体片段的方法，而不必单独筛选每一个片段。可以使用基因工程技术进一步操作这些抗体片段，从而产生用于功能评估的完整抗体。为了从十亿分之一或更少的克隆中富集所需抗体分子，必须通过“淘选”与特定抗原结合的蛋白质进行亲和选择（即生物淘选）。 

在淘选的最后步骤中洗脱的噬菌体可用于感染合适的细菌宿主，从该宿主中可收集噬菌粒，并切除相关 DNA 序列并测序，从而鉴定相互作用的蛋白质或蛋白质片段。DNA 序列可通过进一步基因操作产生所需单克隆抗体，单克隆抗体一旦得到优化，就将其克隆到表达载体中用于生产。

大抗体可能难以表达；较小的（例如，可变域（Fv）、单链可变域（scFv）、双特异抗体（二价 scFv）、骆驼和鲨鱼抗体片段、片段抗原结合（Fab）区）重组抗体片段的发现推动了抗体噬菌体展示技术的发展。

抗体噬菌体展示是一种多功能的体外筛选技术，可用于发现多种抗原（包括毒性和无免疫性抗原）特异的高亲和力抗体。在抗原引导下反复筛选，能够将高特异性的全人源单克隆抗体从噬菌体表面展示的大 Ig 基因库中分离出来。

单个 B 细胞抗体技术利用人体免疫系统的强大反应产生全人单克隆抗体。这些方法只需要几个细胞，这些细胞可以从外周血单核细胞（PBMC）或淋巴组织中快速有效地分离出来。荧光活化细胞分选广泛用于根据细胞表面标志物的表达识别特定 B 细胞，并且使用包被抗原的磁珠和荧光标记抗原（该过程称为抗原引诱）选择抗原特异性细胞。

分离单个 B 细胞后，使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增表达免疫球蛋白的转录本，然后在哺乳动物细胞系中克隆并表达。

单个 B 细胞的分离和克隆可用于快速开发传染病免疫疗法。通过单个 B 细胞法已经产生了用于治疗细菌性疾病、寄生虫病、病毒病和自身免疫性疾病的人单克隆抗体。

通过配体结合检测进行高通量筛选，鉴定与靶抗原结合的抗体。这些检测在开发和生命周期管理阶段的早期进行，用于确定是否形成配体-受体复合物及其性质（如存在）。其通量和准确度必须足够高，以便在药物开发过程的早期排除不良候选物。

以下方法可用于候选物筛选：

在筛选阶段，根据结合强度对与靶抗原特异性结合的“苗头抗体”进行排序，并研究单克隆抗体与靶抗原相互作用的性质。

关键质量属性（CQA）定义为“一种应处于适当的限度、范围或分布内的物理、化学、生物或微生物属性或特征，以确保期望的产品质量[12]。”CQA 是在开发之初定义的，保证最终产品的安全性和有效性。随着时间的推移，由于分析表征、动物研究和临床经验的增加，获得了更多产品知识，可以对 CQA 进行精确定义。最终目标是将 CQA 与临床表现联系起来。

通常很难评估大量与安全性和有效性相关的 CQA，因此可以将 CQA 按类分组，简化评估方法。示例属性类别[13]包括：

采用系统、科学的风险排序和过滤方法能够彻底理解质量属性，并确定质量属性对药物安全性和有效性的影响的关键程度。CQA 的鉴定是一个连续过程，驱动着治疗性蛋白质的结构和功能表征。

正确的开发和表征策略与 CQA 相结合，可以在过程早期识别最有可能成为有效药物的单克隆抗体，并确保生产出安全和一致的疗法。近年来，开发性评估越来越受到重视，早期对单克隆抗体先导候选物的全面评估减少了开发后期的延迟。

由于单克隆抗体和抗体相关产品的复杂性和内在异质性，应仔细进行广泛的生物物理、生物化学、生物、免疫化学和免疫学表征，确保产品的安全性和有效性。稳健的治疗性单克隆抗体表征方法缩短了开发时间，并确保生产出安全、一致、稳定且符合严格监管标准的治疗性单克隆抗体。

一般来说，随着亲和力的增加，由于结合位点的屏障效应，组织和肿瘤的渗透减少[14]。因此，虽然高亲和力可以增加单克隆抗体与靶抗原成功结合的可能性，但确定最佳亲和力对于发挥单克隆抗体的治疗作用非常重要。这是通过亲和力成熟和筛选具有不同亲和力的变体的循环完成的。

使用平衡解离常数 KD 测量对靶抗原的亲和力。KD 是抗体与其抗原之间 Koff 与 Kon 的比值。KD 值越低，亲和力越高。

确定 KD 的方法有多种。例如：凝胶迁移和pull-down检测、平衡透析、表面等离子共振检测、等温滴定量热法、光谱分析和分析超速离心法。

哪种生物测定最适合表征单克隆抗体取决于所治疗的疾病和单克隆抗体的作用方式。

除了确认一级氨基酸序列以外，单克隆抗体的分子表征必须包括分析蛋白质的二级和三级结构以及任何翻译后修饰。

最流行的技术有：

为了安全有效，单克隆抗体必须稳定，并且不形成二聚体或聚集体。聚集体的形成通常与产品或过程相关（例如，柱上聚集体的形成受树脂类型和树脂与生产中特定单克隆抗体的相互作用的影响）。

聚集会大大影响单克隆抗体的生物活性，这种影响通常不可逆。由于聚集体的免疫原性较高，它们也有可能引起副作用并增加消除速率[15]。有多种方法可以分析聚集体：

治疗性单克隆抗体需要一个哺乳动物表达系统，该系统提供糖基化、折叠、定向和共价结合抗体肽链以产生完整的生物功能分子所需的细胞机制。如果产物是单克隆抗体片段，或者糖基化更简单，或者不需要糖基化，可以使用较低的生物体表达平台。 

将关注的抗体基因引入合适的表达载体，并转染到细胞系中用于抗体表达和分泌。表达载体旨在通过宿主细胞密码子优化和填加高效转录、分泌、选择和整合元件使单克隆抗体表达最大化并确保细胞系的稳定。

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生产治疗性单克隆抗体的常见宿主，因为它们适合于高产量生产重组蛋白，并且善于进行翻译后修饰以产生有活性的单克隆抗体所需的正确的高级构象。

哺乳动物细胞系已适应悬浮培养，并被赋予增强功能（例如，引入糖基化途径和细胞凋亡抗性）。这些较新的细胞系支持高细胞密度和产生高滴度单克隆抗体，因此适用于大规模分批补料生产、灌注系统或连续培养技术。商业开发的 CHO 细胞系具有更高的稳定性，用于当前许多单克隆抗体治疗表达平台。

在生物治疗开发早期产生瞬时 CHO 源单克隆抗体的能力非常理想，因为当以生物生产规模生产时，产品将高度模拟单克隆抗体的最终 CQA。

构象和翻译后修饰的变化和杂质可能是由单克隆抗体开发和生产过程中使用的细胞培养基引起的。在培养基优化过程中，糖基化模式、电荷变体、聚集体和低分子量物质可能会发生显著变化。为了开发具有所需质量的单克隆抗体，在整个过程开发过程中，必须采用适当的分析方法对 CQA 进行分析。

糖基化，即酶触发的多糖向单克隆抗体蛋白质主干的添加，是表征产品和保持其质量和安全性时要评估的最重要关键属性之一，因为它影响单克隆抗体的理化特性和药理特性。产生功能活性蛋白需要正确的糖基化模式，但是在通过细胞培养生产单克隆抗体期间和单克隆抗体生产的其他阶段（例如，纯化、配制和储存过程），经常出现不需要的糖基化修饰。可以通过补充或改变培养基修饰多糖图谱。 

单克隆抗体的商业化生产已过渡到低蛋白、无血清、化学成分确定的、无动物源的培养基，这消除了表达可变性的来源和使用动物源性产品的风险。

研究发现，植物和酵母消化物（蛋白胨和水解产物）、表面活性剂（如 Gibco 普朗尼克 F-68 非离子表面活性剂）、DNA 甲基转移酶（氮杂胞苷）和组蛋白脱乙酰酶（丁酸钠和丙戊酸）抑制剂等多种培养基添加剂能够支持细胞活性并增强单克隆抗体表达。

随着我们对疾病潜在分子机制的不断了解，开发新的单克隆抗体药物的机会也将增加。在过去十年中，重点一直是生产用于癌症免疫疗法、炎性疾病和自身免疫疾病的单克隆抗体，但单克隆抗体在治疗和预防真菌疾病、埃博拉病毒和新型冠状病毒 SARS-CoV-2 等传染病方面变得越来越重要。将来，单克隆抗体可用于靶向耐多药病原体，并有助于防止抗菌素耐药性的出现。

治疗性抗体领域也在探索使用新形式抗体，例如识别同一抗原上多个表位的双特异性抗体和三特异性抗体、更容易穿透组织的单域抗体以及将化疗药物靶向特定细胞类型的抗体-药物结合物。一些双特异性抗体和抗体-药物偶联物已上市出售，还有几种在开发中。

有一点可以肯定，治疗性单克隆抗体在未来许多年将继续变得越来越重要。  

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