基因下调老无效?从方案设计到实操,教你避开实验中的「坑」 |
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用微信扫码二维码 分享至好友和朋友圈 基因干扰技术在基因功能研究有着广泛应用,但我们自己在进行方案设计的时候,却面临着很实际的问题:选了 RNAi,担心脱靶,选了 CRISPR 又担心操作和设计太过复杂。怎样选择合适自己的方法?又怎样避开实验过程中的「坑」?是大家共同关心的问题。 丁香园联合吉凯生物,邀请到了一位基因调控方案设计的「老司机」,为大家带来「基因下调方法设计及分子克隆构建」专题讲座,价值千元的讲座课程0 元领取,手把手教你进行基因下调设计,和「隐藏 bug」说 bye bye~ 扫描上方图中二维码,免费报名学习 (讲座之后,奉上基因下调无效的解决思路~) 讲座时间:9 月 22 日 15:30 讲座内容 ●基因下调技术(RNAi,CRISPAR-KRAB,CRISPAR-KO)及适用范围; ● 如何进行「基因分析、靶点设计、blast 比对」; ● 分子克隆全攻略:载体分析及短序列分子克隆实操; ● 基因下调研究中常见问题盘点; 以下为基因下调无效的解决思路~ 目前,基因调控主要通过 RNAi 或者 Crispr/cas9 两种途径实现,这两大技术已经发展完善,应用也非常广阔,但即便如此,也没有任意一家公司能够提供 100%有效的商业化靶点。换言之,基因的 knockdown 或者 knockout 并不简单,这是为何呢? 因为靶点的有效性受限于众多因素,以 RNAi 为例,影响靶点的因素包括: 01 基因的表达水平 表达越低,敲减越难; 02 RNA的二级结构 RNA 本身是单链的,其序列某些区域可能互补,靶点就无法结合; 03 载体结构 不同骨架的载体,表达 shRNA 的水平是有差异的; 04 细胞系差异 同一个靶点,在不同细胞的敲减效率是有差异的; 那么,如何提升靶点有效性,避免无效呢?让我们看看其他科研工作者是如何解决这个问题的吧: 1 长片段基因下调 针对 mRNA、circRNA、lncRNA 这类片段普遍较长的分子,可以由原本的单靶点替换为多靶点 KD/KO,具体实验方案如下: 新思路-多靶点串联验证 Weng1等人针对红色荧光设计了三个靶点,分别构建进入 U6 启动子的载体,同时构建了一个三个靶点串联在一起的载体,并转入带有红色荧光的细胞: 随后,从荧光强度、RNA 水平表达活性、WB 水平表达程度三个维度分析,发现三个靶点串联的 DsRed-3shRNA 下调基因的水平都优于三个单独的 shRNA,证实了,多靶点串联的优越性: dsRed 是外源转入细胞并敲低的,那针对内源性基因,敲低效果如何呢?作者选择卵巢癌细胞高表达的 Akt2 作为靶标,设计单个靶点、双靶点串联、三靶点串联的三种病毒组合,分别感染细胞,结果如下: 上述针对不同基因设计靶点串联构建的形式,在动物水平应用更加广泛。 因为单只动物某一部位注射的病毒量、体积都是受限的,若要同时操作多个基因,难度更大,而多靶点串联对于基因下调则是优选,Platt3 等人使用单个 aav 病毒,运用 cas9 的方式敲除肺腺癌中前三个显着突变的基因 KRAS、p53 和 LKB1,从而建立了疾病模型: 同时敲三个基因,只需要一个病毒即可,是不是十分经济而有效呢? 2 短片段基因下调 针对 miRNA、piRNA、tsRNA 这类序列在 20bp 左右的小分子,当前下调手段主要为合成或表达其反义互补序列。以 miRNA 为例,很多研究者发现,下调后 miRNA 的 QPCR 水平却没有变化,这是怎么回事呢? 《RNA Biology》上一篇文章对于 miRNA 反义核酸的描述如下: 翻译一下: 由上我们可以得知,miRNA 反义序列只是抑制功能,并不能有效降解 miRNA,即便未检测到,正确的做法是直接检测目的基因蛋白水平是否有上调。但若实验者不清楚靶基因的情况下,没有检测到 miRNA 下调,心里便是没底的,那又如何解决呢??? 答案是,反义核酸是在转录后水平发挥功能,要阻断 miRNA 的产生,理想情况是在生成成熟的 miRNA 之前阻断。此要求目前唯有 CRISPR / Cas9 能实现,Cas9 通过在 pre-miRNA 序列中引入突变,从而破坏 miRNA 表达,是 miRNA 基因功能缺失研究的一种新方法,以下案例可以帮助大家更好地理解: (1)案例一 福建肖老师运用 Cas9 技术,针对 miR-21 基因设计 sgRNA ,通过慢病毒递送细胞,并在 RNA 水平检测到 mir-21 的下调表达,从而研究出 miR-21 耗竭对 CNE2 鼻咽癌(NPC)细胞生物学特性及其潜在机制的影响。 A.miR-21 敲除靶点;B、C. 基因组设计引物扩增 DNA 并进行 T7EN1 酶检测编辑效率;B. D.QPCR 检测成熟体表达水平 使用 Cas9 敲除 miR-21 之后,功能上也呈现出阳性: (A-D)miR-21 敲除削弱了 CNE2 细胞的生长,侵袭和迁移能力 (2)案例二 此外,温医大第一医院的张老师使用 Cas9 敲除 mir-545,研究了人环状RNA PRKCI(circPRKCI)通过抑制 miR-545 显示致癌性,促进人类神经胶质瘤细胞的病理进展。 J. miR-545 敲除后的表达水平(Cas9-C 为对照) 所以,CRISPR / Cas9 对于 miRNA 的 KO 是有效的、被认可的、且以 QPCR 检测表达量完全没有问题。 大咖在线教学 本次课程特邀方案设计专家--陈建儒老师在线教学,6 年多的项目实操经验,贡献了多场高水平讲课直播,吸引数万听众观摩学习。陈老师将从方案设计到实操,教你避开实验中的「坑」! 与大咖面对面交流的机会不常有,9 月 22 日 15:30,锁定直播间,速来上车获取高分秘籍! 扫描下方二维码报名领取免费讲座课程 吉凯基因作为优质病毒服务供应商,以 siRNA 合成服务起家,拥有基因操作工具品类众多(慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、HSV 病毒、质粒等)、技术手段齐全(过表达、shRNA、Crispr/cas9 等),并提供众多形式的筛靶服务,感兴趣的童鞋快来咨询设计吧!!! 内容审核:周育红、潘成 题图来源:图虫创意 文章来源:吉凯基因 参考文献: [1] A multi-shRNA vector enhances the silencing efficiency of exogenous and endogenous genes in human cells [2] A simple approach for multi-targeted shRNA-mediated inducible knockdowns using Sleeping Beauty vectors [3] CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling [4] MicroRNA-21 depletion by CRISPR/Cas9 in CNE2 nasopharyngeal cells hinders proliferation and induces apoptosis by targeting the PI3K/AKT/MOTOR signaling pathway [5] Anti-miRNA oligonucleotides: A comprehensive guide for design [6] Lentiviral CRISPR/Cas9 vector mediated miR-21 gene editing inhibits the epithelial to mesenchymal transition in ovarian cancer cells [7] Circular RNA PRKCI promotes glioma cell progression by inhibiting microRNA-545 特别声明:以上内容(如有图片或视频亦包括在内)为自媒体平台“网易号”用户上传并发布,本平台仅提供信息存储服务。 Notice: The content above (including the pictures and videos if any) is uploaded and posted by a user of NetEase Hao, which is a social media platform and only provides information storage services. /阅读下一篇/ 返回网易首页 下载网易新闻客户端 |
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