(二)　HRP标记抗体的方法　　酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。 戊二醛二步法　　1.　原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 　　2.　标记步骤： 　　(1)　称取HRP 25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 　　(2)　反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1min，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅 拌。 　　(3)　将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 　　(4)　用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。 　　(5)　加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 　　(6)　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 (7)　3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于 少量0.15M PH7.4的PBS中。 　　(8)　将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用 萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保 存。 　　3.　结果判定： 　　(1)　定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作 双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。 最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选 择)。 　　(2)　定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。 　　酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4 　　IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 　　　　　　　　　酶量(mg／ml)　　 IgG量(mg／ml) 　　酶量 　　克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4 　　　　　　　　　　40,000 　　　　　　160,000　　　IgG量 　　　(3)　本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的 酶与蛋白质结合。 　　4.　试剂及器材： 　　(1)　0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml， NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。 　　(2)　1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。 　　(3)　1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。 　　(4)　0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。 　　(5)　0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。 　　(6)　PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 　　(7)　萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。      (8)　纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。 　　(9)　HRP(RZ>3.0)。 　　(10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。 　　(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。 　　(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。

简易过碘酸钠法　　本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所 获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重 大损失，是目前最常用的方法。 　　1.　原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以 避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝 基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成 斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 　　2.　标记步骤: 　　(1)　称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。 　　(2)　于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。 　　(3)　将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。 　　(4)　加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立 即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小 时。 　　(5)　加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。 　　(6)　将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。 　　其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。 　3.　结果判定： 　　除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。 　　IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62 　　4.　试剂及器材: 　　(1)　0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水 10ml中。 　　(2)　1mM PH4.4醋酸钠缓冲液: 　　0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml 　　0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml 　　加蒸馏水至2,000ml。 　　(3)　0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液: 　　　　　　　Na２CO３ 0.32克 　　　　　　　NaHCO３ 0.586克 　　　　　　　加蒸馏水至50ml 　　再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。 　　(4)　NaBH４溶液(4mg／ml): 　　临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。 　　(5)　其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。 　　(三)　工作浓度的选择 　　在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓 度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性 反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓 度。 酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系 列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色 反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。 　　其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯 乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依 次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600⋯⋯(根据据抗体的滴度而定)，分别加 入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔 0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO４ 0.05ml终止反应。 　　结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座 标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释 度，即为该标记物的工作浓度。 　　有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。 　　要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差 几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度 (可采用方阵法)，以达到最适的实验条件。 　　(四)　注意事项 　　1.　在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度 高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。 　　2.　所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配 制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂 质)。否则，影响标记效果。 　　3.　室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检 查，防止漏液。 　　4.　浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但 稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。