以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。2、取1.5ml灭菌EP管，取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min4、用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育过夜。7、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM（含丙酮酸钠和非必须氨基酸）。7、转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min，去除沉淀。8、病毒上清-80°C贮存。包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

注意事项：

1.避免使用小量抽提质粒，其纯度相比中抽和大抽而来的质粒纯度较低，可能会降低包装效率。

2.对于基于HIV-1的慢病毒载体而言，依实验目的，可能需要Vpr或者Rev辅助蛋白因子。有些细胞类型需要这些辅助蛋白的参与才能达到高侵染效率。

3.包装细胞系的质量对高效包装病毒非常关键。转染时，细胞密度在40-60%之间比较合适，过低或者过高密度都可能会降低病毒包装效率。细胞开始出现汇合时，需要及时更换或者添加新鲜培养基以保持细胞健康状态。

4.氯喹对细胞有毒性，一般将标准使用浓度之下的氯喹与细胞共孵育的时间控制在8小时之内。或者降低氯喹的使用浓度，延长孵育时间。

5.病毒包装时的细胞培养温度需要综合两方面因素考虑：a)，370C最有利于保持细胞健康状态;b)，320C最有利于维持重组病毒的稳定性。

6.收集病毒上清时的离心步骤可以去除细胞碎片以及少数悬浮的293T细胞。必要时，需要过滤以彻底去除一些细胞成分的污染。

7.冻融会降低病毒侵染效率50%，因此需要避免多次反复冻融。病毒放置于40C时每36-48小时侵染效率下降50%。

8.视实验目的而定，为降低血清成分污染，建议使用低浓度血清培养基。

9.通过使用0.45mm的滤膜不仅可以去除细胞碎片残留，还可以去除VSV-G残留片段对细胞的毒性影响，但同时也会部分影响病毒滴度，所以过滤步骤需要依据具体实验目的而定。

10.使用TNE重悬病毒沉淀时，虽然低体积会增加病毒浓度，然而由于VSV-G介导病毒与细胞的融合，所以高浓度VSV-G对细胞会造成一定毒性，而有些细胞对VSV-G引起的毒性比较敏感，因此最终体积需要依据具体实验而定。

11.超离心纯化病毒步骤可以重复二次，第二次可以使用培养基而不是TNE溶液重悬病毒。

12.使用病毒载体侵染细胞时，细胞密度对侵染效率有较大影响。细胞汇合密度过高会降低侵染效率。

13.侵染所使用的病毒载体体积和病毒滴度，病毒载体的质量以及靶细胞种类有关。

14.使用polybrene之后，需要更换新鲜培养基，因为polybrene对细胞有毒性作用。少数细胞会特别敏感，因此不同细胞polybrene的最佳作用浓度和时间都有所不一样。

15.针对悬浮培养细胞的病毒载体侵染，建议使用Spin Infection方法，此法对于侵染效率低的贴壁细胞同样有帮助。返回搜狐，查看更多