2) 细胞生长状态：感染细胞前，需要保证细胞处于良好的生长状态，以及合适的生长密度，细胞膜的流动性、与细胞表面的接触面积及表面受体的表达丰富等均会影响病毒感染细胞的效果；另外对于悬浮细胞，可以采用离心感染的方法。

3) 病毒质量：包装出来的LV应尽量避免冻融，反复冻融会降低病毒的滴度（每次约降低10%），若一次用不完建议分装后储存于-80℃，但即使-80℃也不建议超过6个月；对于4℃保存的LV则尽量3天内用完。

另外，也可考虑加入Polybrene助感染试剂增强感染效果，但Polybrene本身具有细胞毒性，谨慎使用。

细胞感染后生长状态差？

我们用LV感染细胞是为了进行后续一系列的功能研究，结果感染后细胞生长状态很差完全无法继续实验，这是什么原因？有什么办法呢？

1) 纯化病毒：病毒溶液中残留的杂质蛋白、内毒素及宿主细胞DNA等都有可能造成细胞毒性，严重时可能导致细胞死亡。

2) 调整病毒滴度：MOI值是LV感染实验非常重要的一个指标，我们应在确保细胞状态不受影响的情况尽可能用最少的病毒量。某些对病毒比较敏感的细胞，过高的滴度会严重影响细胞状态，可通过预实验，确定病毒感染的最佳MOI值。

3) 外源基因过度表达：如果过度感染使得外源基因过度表达，可能导致目的细胞代谢失衡从而影响生长状态。

如何确定慢病毒MOI值？

MOI即感染复数，一般将细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。MOI值=病毒滴度（TU/mL）×病毒体积（mL）/细胞个数

1) 查文献：通过高分文献报道确定MOI值。

2) 设计梯度预实验摸索：以文献推荐梯度上下各设置2个梯度，每个梯度至少相差两倍，例如文献推荐MOI值为8，则设置为2-4-8-16-32。

3) 梯度感染后，选取细胞状态较好、荧光较多的，或者药物筛选后细胞存活率较高的梯度作为使用的MOI值。

怎么检测慢病毒滴度呢？

滴度（Titer）：单位体积中有感染能力的病毒数目；单位：TU/mL（活性滴度单位）。

通常来说LV滴度检测：越准确，就越花时间；越省事的，就越不准确。根据并不是所有的实验要求都需要精确检测，例如对于构建基因稳定过表达或干扰表达（shRNA）的细胞株，由于有后续的筛选的过程，就可采取快速检测法（死病毒也会检测出来）。

LV滴度的快速检测包括QPCR，ELISA和试纸法。其差异在于，QPCR法：检测病毒核酸量；ELISA法：检测病毒衣壳蛋白量；试纸法：检测病毒p24衣壳蛋白含量。

而对于做RNAi-screening或CRISPR-screening等研究，则需要精确检测LV的滴度，包括荧光报告基因法和抗生素筛选法。

为什么我用LV做基因的干扰表达效果不好？

对于干扰慢病毒，提高病毒量对干扰效果一般不会有改善效果。干扰效果差一般来说是由以下几个原因导致的：

1）shRNA的特异性：shRNA设计而导致的脱靶效应，重新设计shRNA。

2）干扰机制：促进mRNA降解还是抑制翻译？

3）细胞反馈机制：某些基因表达水平降低会导致核糖体翻译效率上升，表达水平上升。

4）结果判读建议以蛋白为准。

LV过表达效果差？

在我们用LV进行过表达时，常出现以下2种情况：

1) 目的细胞无荧光信号但平行293细胞有信号。出现这种情况最可能的原因为目的细胞不易感，属于难感染细胞，建议适当加大病毒量再尝试。

2) 目的细胞有荧光但目的基因表达无增强。说明转染没问题，且荧光启动子正常工作，若目的蛋白与荧光蛋白是否为同一启动子，包装前可做启动子活性筛选；另外，考虑目的蛋白是否对细胞有毒性，使得目的蛋白被细胞降解。

另外，对于过表达效果差的一般处理办法，可采取：提高病毒滴度、更换载体、避免基因反馈（细胞适应）、以及采用诱导表达的方式。

LV如何介导多个基因同时表达？

1) 若目的基因片段不大，可采用双向/多启动子分别单独启动多个基因。

2) 若目的基因片段较大，可采用单一启动子启动多个基因表达（蛋白融合）。

3) 在不同基因间插入IRES。

4) 在不同基因开放阅读框中插入蛋白酶剪切位点。返回搜狐，查看更多