RIPA裂解抽提总蛋白

1.细胞计数(约1×10ⁿ（n=7）的细胞),离心收集细胞(2000rpm×5min);

2.预冷1×PBS 1ml重悬洗2次,转至1.5ml EP管(2000rpm×5min);

3.去上清,后甩一次,将上清去尽;

4.按照如下比例加入裂解试剂:

RIPA:300ul/1×10ⁿ（n=7）细胞

PMSF:3ul(1:100)

Cocktail:0.3ul(1:1000)

5.吹打均匀,冰上放置30-40min,中间每10分钟Vortex一次;

6.4℃预冷离心:10000rpm ×10min;

7.收集上清,转移至已预冷新EP管,即为总蛋白。

Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白

1.细胞计数(约1×10ⁿ（n=6）的细胞),离心收集细胞(2000rpm×5min);

2.预冷1×PBS 500ul重悬洗一次,转至500ul EP管(2000rpm×5min);

3.去上清,后甩一次,将上清去尽;

4.按每1×106的细胞加50ul loading buffer 加入2×loading;

5.Vortex一下,煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝;

6.每次煮好将其放于冰上,静置约2min,Vortex一下,再甩一下;

7.三次后用枪吸起,如没有粘丝,即可;

8.每次上样约5ul(50ug/ul蛋白)

单层贴壁细胞总蛋白的提取

1.倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。

2.每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH=7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3.按1ml裂解液加10μl PMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)

4.每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5.裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)

6.于4℃下12000 rpm离心5min。(提前开离心机预冷)

7.将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。

组织中总蛋白的提取

1.将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2.加400μl单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中,进行匀浆。然后置于冰上。

3.几分钟后再碾一会儿再置于冰上,要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4.裂解30min后,即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中,然后在4℃下12000 rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

植物组织蛋白质提取方法

1、根据样品重量(1g 样品加入3.5ml 提取液,可根据材料不同适当加入),准

备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4 小时)。

3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

4、提取上清夜,样品制备完成。

蛋白质提取液:300ml

1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml

2、甘油(Glycerol)75ml

3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳!

或者用三氯醋酸—丙酮沉淀法,这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!

1、在液氮中研磨叶片

2、加入样品体积3 倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm

以上1 小时)弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm

以上1 小时),然后真空干燥沉淀,备用。

4、上样前加入裂解液,室温放置30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心

(15℃8000rpm 以上1 小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃

待用。

5、用Brandford 法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。

药品:

提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮

裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml),

使用前再加入1M 的DTT65ul/ml

肿瘤组织

0-4°C 生理盐水冲洗组织表面血迹,以1:9(即100ug 重量加入900ul 体积)

的比例加入蛋白匀浆提取液,0-4 °C 冰水混合物中用1ml 匀浆器制成10%的蛋

白匀浆。匀浆在10000G 离心10-15 分钟,取上清备用。

注:蛋白匀浆提取液(PH7.6):Nacl 50 mM Tris 10mM EDTA 1mM, PMSF 1 mM,

Na3 VO4 .12H2O 0.5 mM NaF 50 mM Benzamidine 1 mM

实验所需试剂

货号

试剂名称-(GBCBIO)

G3424

高效RIPA组织/细胞裂解液（强）

G3425

高效RIPA组织/细胞裂解液（中）

G3426

高效RIPA组织/细胞裂解液（弱）

G3488

PMSF（100mM） 苯甲基磺酰氟

S213

蛋白酶抑制剂(动物）|Protease Inhibitor Cocktail

S216

磷酸酶抑制剂|Phosphatase Inhibitor Cocktail（100X）

T3088

10XPBS缓冲液

G3524

PBS粉剂

SD-100

CelloMeter细胞计数板Nexcelom Bioscience

0854

甘油 | Glycerol | 56-81-5

G3432

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2X)|SDS-PAGE Loading Buffer(2X)

G3422

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)|SDS-PAGE Loading Buffer(5X)

G3155

Bradford蛋白浓度测定试剂盒|Bradford Protein Assay Kit