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Coot Cryo-EM教程2:Fitting和Mutating
翻译自: https://pemsley.github.io/coot/blog/2020/10/20/Coot-Cryo-EM-main.html 本教程专为0.9.1或更高版本而设计。 目的:我们将fit Cleavage and Polyadenylation Factor的domain 1: Setting Up 1.1 Fetch the Files使用Web浏览器下载EMD-3908 bundle: http://www.ebi.ac.uk/pdbe/entry/emdb/EMD-3908下载结构的sequence of a fragment: https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/files/CPF-X-domain.seq将序列文件移动到当前目录(便于访问)。 启动coot: coot --map EMD-3908/map/emd_3908.map 1.2 Map Manipulation观察map: Edit → Map Parameters → Map Radius EM → 70 OK应用smoother map: Calculate → Modules → Cryo-EM Cryo-EM → Sharpen/Blur… activate the “Resample” checkbutton Make Map Close现在应该有一个额外的map(“emd_3908.map Blur 20.00”)。把这张map与原来的map比较一下。你会发现新的(smooth)map更容易理解。 使用Display Manager 删除第一个(mrc)map。 根据经验,较好的default/starting contour level为5.5 rmsd。 1.3 Get the Homolog: File → Open Coordinates… coot_tutorial_2/6f9n.pdb 如果Coot弹出“Nomenclature Errors”对话框,只需点击 “Cancel” 用Display Manager来改变显示方式: 将 “Bonds (Colour by Atom)” 换成 “C-alphas/Backbone”把map移回中间: Cryo-EM → Go To Map Molecule Middle 现在将homolog移动到这里(map的中心): Calculate → Move Molecule Here 选择“6f9n” 分子 Move It还可以更改颜色: Display Manager → Properties → Colour Edit → Bond Colours [滑动滑块]作者偏向使用蓝色map和橙色或绿色model(这是比较好的working配色方案,但不适用于screenshots used in presentations)。 Jiggle Morph → Jiggle Fit This Molecule with Fourier Filter现在应该大致fit了。如果没有,再试一次或两次jiggling。 提取最差拟合(WD40)域: 你可以看到有两条链。 我们想要从larger A链中提取一个WD40 domain 使用Jones'Rainrow,找到domain start 和 end 的残基编号(您正在尝试寻找符合这个doughnut-shaped density的doughnut-shaped分子) 假设您认为结构域末端的残基是517和1011: Edit → Copy Fragment → [Use 6f9n molecule:] //A/517-1011 → OK让我们研究这个片段: Display Manager → Last Only Reset View让我们从 atom selection molecule中删除侧链(通常为number 4): Calculate → Modelling → Delete Side-chains for Active Chain对于最新的model(列表底部),在Display Manager使用: C-alphas/Backbone OK [关闭Display Manager]我想在这里指出的是,在一台拥有多核和线程的现代计算机上,这是一种令人愉快的体验。如果这与您的计算机不同,则以下部分可能会令人困惑和沮丧。 Refine → Chain Refine {请等待并观察,如果您愿意,您可以翻转视图(注意不要单击原子)… 在我的计算机(2019年的PC)上大约需要20秒} 细化对话框显示“Success”时: 现在就Accept,让我们在不那么严格的Geman-McClure约束下再改进一次: Refine → Set Geman-McClure alpha 0.1 Refine → Chain Refine {等待并观看大概10秒}
决定需要移动什么以及如何移动它可能不是一件微不足道的事。需要撤销修改,并再次实践。 在显示距离限制的情况下: 撤消(左箭头图标) Calculate → Scripting → Python set_draw_moving_atoms_restraints(1) Refine → Chain Refine 根据需要拉动 OK或者使用不同的Geman-McClure cut-off,或者使用不同的Geman-McClure约束的Alpha,或者使用不同的weight for the map。或者不同的blur for the map。 可以使用Restraints → Delete All Extra Restraints来删除当前的所有额外约束。 尝试proportial editing比例编辑:在激活Real Space Refinement的情况下,使用Ctrl鼠标中键滚动更改受原子拉动位移影响的原子半径。 Test, play, refine, yank 直到 satisfied。 将Geman-McClure Alpha重置为1: Refine → Set Geman-McClure alpha 1 6: Review and Trim在查看时,您会注意到model的某些部分与map不符。试着用Tandem Refine把它们拽来拽去。模型的其他部分没有密度-所以删除residue range-可能有助于接下来的 alignment 。 也许density fit validation dialog会有用。您可能需要重置权重:1.5似乎是个不错的数字: Validate → Density Fit Analysis(选择“atom selection from pdb6f9n”)这是Coot’s版本的“Homology Modelling”–只是模型几何优化是在经验数据的背景下进行的: 我们已经完成了 “Self Restraints” - 删掉: Restraints → Delete Extra Restraints Coot将显示一个molecule chooser dialog: 选择 “atom selection from pdb6f9n.ent”分子 OK Calculate → Use ClustalW for Alignment, Then Mutate 突变的链在“atom selection from pdb6f9n.ent”,目标序列在文件中 CPF-X-domain.seq {wait} Refine → Chain Refine {wait} OK
逐个检查结构残基,寻找需要修复的地方(这可能需要一些时间,所以在进入8.2节之前,您可能只需要做一些尝试) 8.1 Do some Fix-ups Out of register errors Missing side-chains Missing loops Loops with too many residues in the model Bad rotamers Bad peptides Clashes Use: Validate → Alignment vs. PIR… 帮助调节残基数量有些地方需要通过对残基重新编号来关闭(或打开)loop。 用Validate → Validation Outliers 或 Validate → Overlaps, Peptides, CBeta, Rama and Rota Outliers可以使用“K”在屏幕中央添加残基,并使用“Shift K”删除侧链原子。 8.2 Unclash改进工作的一部分是改变将非粘合接触降至最低的方式。减少/移除原子重叠(或莫雷米蒂将其称为“冲突”) 首先确定正在修复domain的model number-对作者来说是2 现在将氢原子添加到该模型中: Calculate → Scripting → Python coot_reduce(2) Refine → Chain Refine {等待-这比以前花费了更多时间-现在有很多interactions} Accept对于你的notes,现在不要对此采取行动,删除氢原子,请使用Python脚本函数delete_hydrogens(4)(加你的number)} 8.3 Ramachandran Outliers使用Ramachandran约束可以方便地改进模型验证。我是这样做的: Click the R/RC 按钮 勾选 Use Torsion Restraints 勾选 Ramachandran Restraints OK Validate → Ramachandran Plot [and chose the “atom selection” molecule] Outliers Only现在点击一个红点-有许多(可能是50左右): 看看这个模型。有时,离群值是有问题的,因为存在建模错误-您不能使用Ramachandran restraints来修复此类问题。 但有时,是好的,只是主链的扭转角torsion angles需要调整: Tandem Refine 现在,翻转和反转Peptide或Next Peptide 通常可以解决这个问题。 如果需要,您可以使用 Refine 菜单中的菜单项更改 Ramachandran restraints weight。 (但请注意,当 Ramachandran weights很高时,Coot 经常会 upset。) 9: Done你可以通过与参考模型进行比较来检查你做得有多好–它的code是6oej。 coot_tutorial_2/3eoj.pdb提示:如果没有Morph选项需要手动添加 参考:https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/web/tutorial/Coot-Cryo-EM-basics.html Install a Few Extensions Calculate → Scripting → Python curlew()弹出窗口 ,在这里去选择安装“Black Box Morph and Fit”, “Chain Refine” 和“Morph”等 |
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