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388

作者：

张家林

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摘要：

猪德尔塔冠状病毒(Porcine dekacoronavirus,PDCoV)属于冠状病毒科,δ冠状病毒属成员,是一种新型肠道冠状病毒,可引起不同日龄的猪只感染并表现出腹泻,呕吐,脱水的临床症状. 疫苗免疫,尤其是母猪的被动免疫是预防和控制腹泻性病毒(PEDV,TGEV,PoRV和PDCoV)感染最有效的方法.目前,PDCoV缺少商品化的疫苗,对疫病的防控无疫苗可用.因此,灭活疫苗的制备及免疫评价对PDCoV的防控显得尤为重要. 本研究首先在5日龄SPF猪上对PDCoV分离株PDCoV NH P10的致病性进行研究,结果表明以104TCID50口服感染1mL病毒,攻毒后24h,出现典型的腹泻的临床症状.剖检显示肠壁变薄,内有淡黄色液体.病理切片HE染色表明,空肠和回肠的肠绒毛在感染后72h出现明显的萎缩,变短和脱落.空肠和回肠是PDCoV感染的主要肠段.与文献报道不同的是PDCoV NH株感染后没有出现呕吐的临床症状. 同时,本研究在猪回肠细胞系IPI-2I细胞上研究了PDCoV入侵细胞的分子机制,结果表明PDCoV可以通过两种途径感染细胞,一种是由胰酶介导的细胞膜表面途径,另外一种是由组织蛋白酶L(CTSL)和组织蛋白酶B(CTSB)介导的内吞体途径.进一步研究表明,通过细胞膜表面入侵的效率比内吞体途径高10～100倍.病毒感染之后,在细胞上及感染PDCoV的小肠组织中均提高了CTSL和CTSB的表达,并在体外细胞水平上提高了CTSB的酶活性. 为评价灭活疫苗的被动免疫保护效果,通过后海穴注射的免疫途径,分别在产前40d和产前20d对妊娠母猪进行免疫,在母猪分娩后让新生仔猪采食初乳,并在5日龄进行攻毒.根据临床发病,病理损伤及排毒情况对灭活疫苗的被动免疫保护效果进行评价.结果表明,母猪免疫灭活疫苗后在血清及母乳中可诱导IgG及中和抗体应答,仔猪通过吸食母乳可获得被动免疫保护.攻毒实验表明,灭活疫苗可为仔猪提供87.1%的被动免疫保护率. 除了被动免疫为仔猪提供被动免疫保护外,主动免疫可以提高猪只的免疫水平,减少PDCoV感染的风险.首先我们模拟自然感染,对25日龄的SPF猪进行了口服感染实验并监测抗体水平.结果表明口服感染后第5天可引起25日龄断奶猪产生腹泻的临床症状.抗体检测结果表明,在第3次口服感染后抗体水平迅速升高,同时可检测到高水平的IgA.为评价主动免疫的效果,我们采取了三种免疫策略:灭活疫苗两次免疫(K+K);活疫苗首免,灭活苗加免(L+K);活疫苗两次免疫(L+L).结果表明,三种免疫策略在免疫后两周,中和抗体转阳,在加强免疫后抗体水平迅速升高.K+K免疫组的中和抗体水平要高于其它两组.并且在免疫后两周K+K免疫组在血清中就可以检测到高水平的IFN-γ,说明灭活疫苗免疫也可以激活细胞免疫应答.组织毒攻毒实验结果表明,K+K免疫组的保护效果要高于其它两组.以上结果说明采用灭活疫苗间隔两周免疫两次的免疫策略可以诱导较好的中和抗体应答并为猪只提供保护.

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关键词：

病毒入侵 分子机制

学位级别：

博士

学位年度：

2019