自然环境中存在的微生物远远比目前所培养的微生物数量多[1]。此外，一些关于16S rRNA基因序列的分析和微生物培养研究证明，有大量的微生物没有对应的培养方法[2]。本文中所提到的“未培养”将用来描述之前在人工培养基中还没有被培养的微生物。研究发现自然界中能够被培养和分类的微生物只占很小比例，大约占1%，也就是所谓的“大平板计数异常”(样品中微生物细胞的数量与营养培养基上形成的菌落数量并不相符，并且显微计数要明显高于菌落数量[3])。同样地，来自环境栖息地的未培养微生物的比例据估计大约是99%[4]。目前估计在细菌的61个门中有31个门是不能被培养的[5]。古菌中只有54种是可培养的，而且它们仅代表了复杂生物多样性的一小部分，49个谱系中绝大多数都还是未培养的[5]。

未培养微生物不能被培养并不仅是由于低丰度，而且还包括一些抵制培养的特殊原因，包括温度、pH、氧利用率、营养来源等。此外，面对不利的生长环境，为了生存细菌可能进入了一种“有活性但不分裂的状态”或“休眠的状态”，也就是细胞是活着的但是不再分裂[6]，并且仅当外部的条件变得更加有利或提供了合适的生长因素和信号，细菌才能够复苏。近年来越来越多的证据表明，活性氧簇具有生长抑制效果，例如过氧化氢能够导致氧化应激和细胞损伤，由于在人工生长培养基中产生了过氧化氢，导致微生物的生长效率明显降低[7]。富营养培养基中的高浓度营养成分或细菌素以及混合培养时邻近细菌产生的其他类型抑制因子可能会对细菌生长产生抑制作用。同时，自然环境中细菌群体中的个体成员，特别是那些以生物膜形式出现，通过细胞间的小肽或群体感应产生信号进而出现细菌间互相协作和相互作用的现象[8]。与这一结论相似的是，生长在牙菌斑生物膜上的细菌个体间可以形成严格的和可再生的结构关联，这一现象暗示细菌个体之间有清晰的功能关联[9]。因此，当试图避开宿主群体和有利的互作网络单独分离纯菌，它们可能并不会生长。某些微生物生长过程需要共培养细菌产生的信号和化学因子的刺激，因此这种刺激的缺乏可能是阻止体外分离培养微生物最重要的因素之一。同时，通过对Erysipelotrichia谱系进化树的研究发现，在进化的不同阶段都伴随着基因的缺失，进而引起代谢功能和形成内孢子能力的变化[10]，另外，候选种Saccharibacteria (之前的TM7)、SR1、WWE3和OD1，其中有一段小的基因组缺失了调控某个关键生物合成路径的基因[11]，这样的细菌可能仅生存在与宿主有紧密联系的表面或体内。例如最近培养的Saccharibacteria菌株TM7x与龋齿放线菌和细胞内的病原体惠普尔养障体形成了一种紧密的共生关系[12]，以上两类细菌都存在调控氨基酸合成路径的基因组缺失的情况。因此，分离这类依赖性强的细菌具有极大的挑战。

虽然分子生态学和宏基因组学已经明显增加了我们对于微生物多样性的了解，并且引导产生了许多有趣的假设，但是这些先进的技术也显示出我们距离充分阐明微生物多样性还很远。同时，考虑到许多基因储存在具有未知功能或错误注释的数据库中，仅使用宏基因组学的方法不能提供足够的信息去培养所有的微生物。实际上，只有通过细菌纯培养的研究才能充分地阐述其表型和基因型。考虑到微生物培养在现代微生物学中的重要性，分离培养未培养微生物仍然是优先考虑的思路。因此，一个重要的挑战就是如何克服目前存在的限制因素，扩大可培养的范围。本文将综述目前未培养微生物分离培养技术研究进展(表 1)，为分离未培养微生物和研究其生态学功能提供参考。

任何微生物的生长都需要能量、营养和适当的物理化学成分，并且不同的微生物所需的浓度是不同的。某些微生物在生长的过程中，需要特殊的营养物质、pH条件、培养温度和合适的氧气浓度。Köpke等研究不同的培养基基质和培养条件对微生物生长的影响后发现，不同的条件下微生物生长出现明显差异[21]。

自然环境中的大部分微生物都是群体生活，并且相互之间建立了复杂的关系。在实验室培养条件下，单纯地将待培养的微生物与其他相关的微生物群体分开，物种之间的信息交流被阻断，微生物因缺乏必需的生长因子和信号分子而无法生长，表现为不可培养。在原核生物中，种间互作普遍存在并且不会受到信号分子的限制，例如自体诱导分子2 (AI-2)和N-酰基-高丝氨酸内酯[22]。

在某些情况下，培养效率随着培养时间的延长而明显增加。许多微生物，特别是生活在营养不充足环境中的微生物生长速率是很慢的。因此，延长培养时间是提高这类微生物培养效率的先决条件。Davis等培养土壤微生物至少12周的时间，结果显示菌落计数明显增加并且分离出几株之前未培养的菌株[23]。

对于某些微生物生长速率慢、产量低的情况，如果检测技术灵敏性不高，很可能得出错误的结论，因此开发多种高灵敏性检测方法对于认识未培养微生物具有很大的作用。对于要通过菌落数量来研究其生理生态特性的微生物，高灵敏性的检测方法如切向流过滤是极其重要的[24]。

在生长的过程中，许多微生物有特殊的营养物质和化学物质的需求[25]。这就需要对微生物生存的自然环境和特性有深刻的理解，包括与培养基生长直接相关的各种因素，才能有助于研究者更好地理解这些因素并进一步开发培养未培养微生物的方法。最近的一些研究探究了不同成分和浓度的培养基对于培养未培养微生物的影响。Li等应用体外培养方法，在厌氧培养基中添加十八碳烯酸(TVA)至不同终浓度(0、30、40、50、60 μg/mL)，接种瘤胃微生物后进行连续和传代培养，传代富集培养时，用DGGE监测菌群变化，发现当传至第4代，TVA氢化菌群的数量增加最显著，对差异条带的测序结果表明这些细菌大多属于未培养的瘤胃细菌[13]。Davis等[23]和Sait等[26]参考系统发育相关菌种，通过修饰和富集培养基成功地分离出之前未培养的微生物。微生物学家通过在培养基中加入氢氧化铁和锰氧化物作为电子受体，实现了微生物的高效培养，例如变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、疣微菌门和盐单胞菌门[21, 27]。Kashefi等根据嗜高热微生物利用Fe(Ⅲ)作为终端电子受体这一高度保守的特性，在培养基中添加非常微量的Fe(Ⅲ)氧化物。该方法的前提是对微生物特性有一定的了解[28]。Santini等从Aodaliya金矿中分出以亚砷酸为电子供体，氧为受体，以CO2为唯一碳源的优能自养菌(NT-26)，16S rRNA基因序列分析表明，NT-26属于α-Proteobacteria土壤杆菌的一个根瘤菌分支，可能是一新种[29]。一些研究关注甲烷厌氧氧化对于硫酸盐或硝酸盐的还原作用。这些方法需要精确的培养基，其中包括碳氢化合物能量来源和硝酸盐，铁和硫酸盐作为电子受体[30]。

对来自北海的样本进行的研究显示，碳源的品质是决定培养效率的关键因素。包含不同碳源和复杂化合物的培养基所培养出的微生物数量和多样性比只含有一种碳源的培养基更高[30]。相反地，许多自养微生物不能在只有一种固定碳源的培养基中生长[31]。目前，通过使用低底物浓度的培养策略，针对未培养微生物的培养已经取得一些成效[30, 32]。放线菌门、酸杆菌门、变形菌门和疣微菌门利用低营养培养基和增加培养代数进而被成功地培养[33]。改善培养条件(如营养水平，氧气浓度，腐殖酸的添加和信号分子)也增加了一些新型微生物[34]。最近，科学家创新地开发出高选择性培养基，最大的优势是该培养基对特定的微生物具有高选择性。这种方法被用来开发选择性培养基培养水稻细菌性谷枯病菌、燕麦食酸菌、果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌[35] (表 2)。在培养基中添加腐殖酸、信号分子、处理活性氧的酶类[30, 34]或移除某些抑制因子提高未培养微生物的培养性。一些微生物学家证实吉兰糖胶对于未培养的微生物的培养和分离是有效的，因为它的平板成分比琼脂要更清楚，因此更容易找到非常细微的菌落[33, 36]。吉兰糖胶也可能增强受琼脂抑制的微生物的生长[36]。吉兰糖胶培养基上的菌落计数是琼脂培养基的10倍。生长在吉兰糖胶培养基上大约60%的微生物被认为是新的，在同样的条件下，新分离得到的微生物中的一半在琼脂培养基上不能形成菌落。

共培养也是一种培养兼性或互养微生物的有效方法。到目前为止，两种成功的例子已经被报道：(1)一种利用透析膜反应器的群体培养方法已经成功地从厌氧淤泥中培养出厌氧嗜热的降解谷氨酸的微生物[38]。(2)另一种利用在厌氧和需氧交替的间歇反应器中的群体培养成功富集到混合微生物[38]。新的微生物通过与耗氢型微生物共培养或使用适合生长的纯培养基质得以成功地鉴定[36]。另外，在很多情况下，不同技术结合使用已经取得了成功。例如，通过将适合生长的环境条件与辅助菌株结合使用，Nichols等培养出一种新的嗜冷杆菌属[39]。辅助菌株提供了必要的生长因子，这些生长因子对于使用人工培养基培养未培养菌株是重要的发现。其他的研究者已经使用非共生的变形虫作为一种工具来分离环境样品中(包括土壤)新的胞内微生物[40]。

Kvist等[17]从环境样本提取细胞后，使用Cy3标记的探针进行荧光原位杂交。用显微操纵器将标记有明亮萤光信号的单细胞分离，并用单个分离的细胞作为多重置换扩增的模板(图 5)。多重置换扩增的产物随后用于16S rRNA基因序列分析。结果显示 > 99% 16S rRNA基因与土壤泉古菌SCA1170分支具有同源性。用此方法分离了一株土壤泉古菌。但是应用该方法有两个限制因素，一是存在序列偏差，尽管各种改进的策略正在逐步减少这些缺陷，高覆盖率、高保真性及高特异性的扩增仍然是亟待解决的问题；二是由于核糖体RNA很强的进化保守性，从而导致以其为基础的系统发生分析的分辨率比较低，如16S rRNA基因就无法完整地表征菌株(基因型)的特性。因此，我们必须进一步改进这种技术的操作过程，以寻求更为有效的方法来减少非靶向生物体及外源DNA的污染等情况的发生。另外，对测序得到的大数据的分析也是一个重大的挑战。

未培养微生物在自然环境微生物群落中占有非常高的百分比(约99%)，无论是其物种类群，还是新陈代谢途径、生理生化反应、产物等方面都存在着不同程度的新颖性和丰富的多样性，因而其中势必蕴含着巨大的生物资源，具有非常可观的应用前景。首先，在生物降解方面，厦门大学微生物研究所的实验室从在生态环境中寻找未培养微生物及其降解基因的角度出发，应用宏基因组技术构建文库，在寻找抑制赤潮藻类的相关基因及PAHs高效降解基因已进行了大量研究，已取得初步研究成果，期望在未培养微生物中寻找高效功能基因并应用于污染的生态环境治理。其次，在药物筛选方面，Ouyang[57]利用琼脂糖凝胶包埋法从中国南海的多种海绵中分离得到超过400 kb大小的细菌DNA片段，并用获得的大片段DNA构建了海绵Halichondria sp.的BAC文库。此外，在酶类资源发掘方面，多位科学家利用功能性筛选可以快速地从多个克隆子中鉴定出全长基因，并由此获得这些功能基因的产物，为工业、医药和农业提供一些新的天然活性物质如各种酶类及一些次生代谢产物等，包括4-羟基丁酸脱氢酶、N-酰基酪氨酸合成酶、几丁质酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶等。

目前为止，因为单纯的基因测序无法解答微生物群落功能和代谢，因此，分离未培养微生物的方法越来越受微生物学者关注。然而，传统的方法存在分离效率低、操作复杂、设备昂贵或缺乏群体交互作用等缺点，难以分离特定功能微生物(群)。因此，本文综述了改良培养基、共培养、原位培养、单细胞捕获分离、荧光激活细胞分离技术、培养组学、微液滴培养法等新方法，并且提出必要时可几种培养手段相结合，优势互补，从多个角度对未培养微生物进行分离培养。同时，我们要发掘未培养微生物丰富的基因资源，发现新的酶类和化合物。基于以上研究现状，笔者认为，未来还应在以下几个方面加强研究：

(1) 笔者实验室从事瘤胃微生物分离培养研究工作多年，在厌氧滚管技术[58]和调整培养基[13]等方面均进行了很多探索，目前通过富集培养已成功从奶牛瘤胃中分离得到具有TVA氢化能力的微生物菌株一株；从瘤胃壁上分离得到地衣芽孢杆菌和奇异变形菌，从瘤胃液中分离获得白色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌和布氏密螺旋体，总共5种尿素分解菌，为进一步认识瘤胃微生物提供理论依据和方法基础。同时，我们实验室发明了一种基于短序列的引物设计来定量差异细菌的方法，并成功运用了基于短的16S rRNA基因序列设计的引物定量目标未培养细菌，结果发现与饲喂混合粗饲料的奶牛瘤胃微生物相比，饲喂秸秆粗饲料的奶牛瘤胃中显著减少的未培养细菌R-UB来源于Succinivibrionaceae，有助于我们通过针对性地调控瘤胃微生物来更好地利用秸秆粗饲料资源[59]。此外，我们利用自主研发的人工瘤胃模拟系统，以尿素和脲酶抑制剂(乙酰氧肟酸)分别作为尿素分解菌的激活剂和抑制剂，通过高通量测序技术研究细菌16S rRNA基因变化，揭示瘤胃优势尿素分解菌群。最终揭示了瘤胃优势尿素分解菌：Pseudomonas、Streptococcus、Haemophilus、Bacillus、Neisseria、Actinomyces和Succinivibrionaceae[60]。该研究解决了纯培养难题，这对于胃肠道重要功能菌群的鉴定提供了新的研究思路。另外，奶牛瘤胃尿素分解菌群的鉴定，为调控瘤胃尿素代谢和提高尿素氮利用率提供了新的调控靶标。但是一方面由于我们仍然缺乏对微生物的多样性、生存环境以及在生物进化中地位的认识，无法设计微生物生长的原位环境实现群体培养，导致依赖其他微生物的代谢活动或者其他环境条件中的微生物不能生长。另一方面，缓慢生长的或稀有的微生物经常在培养和测序的过程中被丰度相对高的微生物所掩盖。因此还需继续加强对微生物生理环境的分析研究，解析影响未培养微生物不能培养的关键营养因子。

(2) 虽然以共培养、原位培养、单细胞捕获分离、荧光激活细胞分离技术、培养组学、微液滴培养法等为代表的分离培养技术近年来迅速发展，但一些常规方法(如传统微生物培养法、厌氧滚管技术、改良培养基等)也不能完全摒弃。应该将多种技术相结合，为探究环境中微生物分布和多样性，解析不同环境条件下微生物生态功能，挖掘环境中未培养微生物，更新和完善微生物数据库等提供新的方法学支持。

(3) 必须全面理解微生物生理适应性与群体行为，发展和革新培养技术，改变微生物培养方式，设计尽可能接近微生物生活的自然环境，培养出更多的“不可培养微生物”，推动来源于未培养微生物的新基因、新活性物质和天然产物等资源的挖掘利用。