灵芝Ganoderma lingzhi（戴玉成等 2013）是名贵的食药用真菌。现代医学研究证明,灵芝具有增强人体免疫力、调节血糖、控制血压、抗肿瘤、保肝护肝、促进睡眠等功效（Xie et al. 2006;Pan et al. 2013;Loganathan et al. 2014）。灵芝主要药理活性物质为灵芝多糖和灵芝三萜类化合物,另外还有甾醇类、生物碱类、多肽类等。灵芝三萜具有抗肿瘤、保肝护肝、降血糖、抗HIV等显著功效而被人们所重视,近年来又发现其具有补体的作用,诱导NADPH的作用等功效（吴锋等 2012）,因此对灵芝三萜类物质提取方法的研究具有重要意义。

灵芝三萜提取方法有回流浸提法（陈慧等 2015）、超声波提取法（洪文龙等 2014;姚松君等 2009）,超临界CO2提取法（宋师花等 2008）和微波提取法（蒉霄云等 2010）等。微波-超声波协同提取法是充分利用微波的高能作用以及超声波振动的空穴作用,克服了常规微波提取和超声波提取的不足。近年来其在中药活性成分提取应用上逐渐兴起（周明等2009;姜笑寒等 2011）,但其在灵芝三萜的提取应用鲜见报道。本文旨在将微波-超声波协同提取法应用于灵芝三萜类化合物的提取,对其提取工艺进行优化,选出最佳的超声波-微波协同提取灵芝三萜的工艺,为高效快捷地提取灵芝三萜类化合物提供理论依据。

灵芝子实体（购于大别山产区）,齐墩果酸标准品（Sigma公司）,标准品灵芝酸A和灵芝酸B（北京万佳首化生物科技有限公司）,香草醛、冰醋酸、高氯酸、甲酸、无水乙醇、甲醇等均为国产分析纯。

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图1   微波-超声波协同提取装置示意图

Fig. 1   The principle diagram of microwave-ultrasonic extraction device.

1.2.1 微波-超声波协同提取：超声波和微波通过发生装置激发,经波导管传送作用到样品容器,通过电子检测控制系统控制超声波和微波强度,通过冷凝回流装置实现溶剂循环利用并最终提高提取效率。

1.2.2 灵芝总三萜测定方法：以齐墩果酸为标准品,采用紫外分光光度法。

标准曲线的制备：以甲醇为溶剂,配制齐墩果酸标准溶液浓度为0.1mg/mL。分别吸取标准溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL于6只带塞试管中,60℃烘干,每管依次加入5%的香草醛冰乙酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,迅速摇匀后于70℃水浴15min。水浴完立即冷却,加入冰乙酸5mL,摇匀,545nm处测定吸光度。以齐墩果酸浓度C为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为：A=13.686C-0.089 2,R²=0.999 7。

灵芝三萜提取与计算方法：准确称取1g灵芝子实体粉末,按料液比1:40、提取液乙醇浓度95%、超声波功率500W、微波600W、提取时间30min、提取温度60℃条件提取三萜,提取后减压过滤收集上清液,上清液蒸干后甲醇定容至50mL,按绘制标准曲线的方法测定吸光度,根据公式计算灵芝三萜提取率W[单位以每克计（mg/g）]。计算公式如下：

W=C×V/md

其中：C：灵芝提取液总三萜浓度（mg/mL）;V：提取液体积（mL）;md：灵芝子实体干重（g）。

1.2.3 不同提取方法的比较：微波-超声协同波提取法与微波提取法、超声波提取法、回流提取法、常温浸提法相比较。微波-超声协同波提取法见1.2.2;常温浸提法：料液比1:40,95%乙醇常温浸提36h;回流提取法：料液比1:40,95%乙醇,90℃条件下回流2h;超声波提取法：参照1.2.2微波-超声协同波提取法,不设微波功率;微波提取法：不设超声波功率,其他条件与1.2.2相同。

1.2.4 单因素试验：在1.2.2的基础提取方法下,研究料液比、提取时间、提取温度、超声波功率、微波功率和乙醇浓度6个因素对灵芝三萜提取率的影响。各因素具体为：料液比例（1:20、1:30、1:40、1:50、1:60）,提取时间（5min、10min、20min、30min、40min）,提取温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）,超声波功率（100W、300W、500W、700W、900W）,微波功率（200W、400W、600W、800W、1000W）,乙醇浓度（45%、55%、65%、75%、85%、95%）。

1.2.5 灵芝三萜提取工艺优化：利用响应面分析法对灵芝三萜提取工艺进行优化,据Box-Behnken的中心组合试验设计原理,结合单因素试验结果,选取A：时间（15min、20min、25min）,B：微波功率（500W、600W、700W）,C：超声波功率（600W、700W、800W）,D：乙醇浓度（60%、70%、80%）4个因素,每一个自变量的低、中、高试验水平分别以-1、0、1进行编码,以三萜提取率为响应值。

1.2.6 灵芝总三萜中灵芝酸A和灵芝酸B含量测定：取1g灵芝子实体粉末,经微波-超声波协同提取后,提取液浓缩至干,提取物用三氯甲烷萃取3次,合并滤液,过滤,蒸干,提取物用甲醇溶解,定容至50mL,摇匀,溶液经0.45μm微孔滤膜过滤,即得待测样品。

色谱条件：Browmlee Validated C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）;流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液;采用梯度洗脱,洗脱条件为0-5min,25%-30%乙腈,5-50min,30%乙腈,50-60min,30%-35%乙腈,柱温25℃,流速：0.8mL/min;进样量10μL;检测波长254nm。

1.2.7 灵芝三萜类清除DPPH能力测定：将微波-超声波协同提取液经过旋转蒸发仪浓缩至膏状,冷冻干燥得灵芝三萜类粗品,灵芝三萜粗品配成0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的浓度进行清除DPPH实验,分别取0.8mL待测液,加入1.2mL甲醇,再加入2mL浓度为2×10-4mol/L DPPH,暗室反应30min,于517nm处测定OD值。清除DPPH测定方法参照Li et al.（2012）的报道,每个样品测3次,将样品浓度与其自由基清除率进行线性回归,得线性回归方程,再由该方程计算清除50%自由基时所需的样品浓度,即IC50值。根据下面公式计算提取物对 DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100%

其中：A0为DPPH溶液本身的OD值（空白对照）,A1为加有样品或者阳性对照的DPPH溶液的OD值。

微波-超声协同波提取法与超声波提取法、回流提取法、常温浸提法相比较表明,微波-超声波协同提取法对灵芝子实体总三萜的提取率最高,为11.48mg/g,且提取时间最短,说明该提取方法的提取效果显著优于其他3种提取方法（表1）。

表1   不同提取方法对灵芝三萜提取率的影响

Table 1   The influence of different extraction method on Ganoderma lingzhi triterpenoid extraction rate

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单因素对灵芝总三萜提取率的影响结果表明,当料液比达到1:40后灵芝三萜提取率趋于稳定,提取率在10.5mg/g左右。灵芝三萜提取率先随时间的增加而增多之后又开始下降,提取时间在20min时提取率最大,为11.48mg/g（图2A）。灵芝总三萜提取率随温度的增高而增加,当温度达到70℃时,总三萜提取率达12.47mg/g,之后三萜提取率又有所下降（图2C）。随微波功率的增加灵芝三萜提取率先增加之后又开始下降,当功率为600W左右时,三萜提取率最高为11.14mg/g（图2D）。随超声波功率的提升,灵芝三萜提取率亦呈先增加后又下降的趋势,灵芝总三萜提取率在功率700W时最高,为11.88mg/g（图2E）。灵芝总三萜提取率随乙醇浓度的变化而变化,当乙醇浓度在在75%时三萜提取率为12.60mg/g,浓度再增大提取率则降低（图2F）。

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图2   单因素试验结果 A：料液比对灵芝三萜提取率的影响;B：提取时间对灵芝三萜提取率的影响;C：提取温度对灵芝三萜提取率的影响;D：微波功率对灵芝三萜提取率的影响;E：超声波功率对灵芝三萜提取率的影响;F：乙醇浓度对灵芝三萜提取率的影响

Fig. 2   Result of single factor test. A: The effects of solid-liquid ratio on Ganoderma lingzhi triterpenoid extraction rate; B: The effects of extractive duration on triterpenoids extraction rate; C: The effects of temperature on triterpenoid extraction rate; D: The effects of microwave power on triterpenoid extraction rate; E: The effects of ultrasonic power on triterpenoid extraction rate; F: The effects of ethanol concentration on triterpenoid extraction rate.

2.3.1 回归模型：在单因素试验结果的基础上,利用响应面分析方法对微波-超声波协同提取灵芝三萜工艺进行优化,实验水平因素设计方案和结果见表2。利用Design-Expert 8.0.6.1软件对表2的数据进行分析处理,并对响应值与A提取时间、B微波功率、C超声波功率和D乙醇浓度4个因素进行回归拟合,建立数学回归方程为：Y=12.87+0.14A+0.36B+0.36C+0.73D-0.14AB+0.024AC-0.071AD-0.1BC+0.059BD-0.035CD-0.58A2-0.35B2-0.49C2-0.84D2。

表2   响应面优化实验设计及结果

Table 2   Experimental design and results of optimizing test using response surface method

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2.3.2 模型方差分析：模型方差分析结果,模型P0.05,差异不显著;相关系数R2=0.938 0,说明实验测量值和预测值之间的相关性较高,方程的拟合度较好。变化系数CV=2.37,说明实验可信度和精确度较高,B项（P=0.000 7