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引物的设计以及初步筛选

引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成

的，

目前运用软件

Primer Premier 5 

或美国

 whitehead 

生物医学研究所基因组研究中心

在因特网上提供的一款免费在线

PCR

引物设计程序

 Primer 3

来设计引物，

再用软件

Oligo 

6

进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。但是对于初学者来说，运用软件和

程序来设计引物好象无从着手，

其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，

所有

问题便迎刃而解。

因为无论是软件还是程序，

都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来

进行引物设计的。

所以，

我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过

多的时间来思考，

如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。

下面我们主要讨

论一下引物设计的原则和注意事项。

①引物的长度一般为

15-30 bp

，最好在

18~24 bp

，因为太短易形成错配

(F

alse priming) 

降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量

[21

。

②引物在模板内最好具有单一性，

也就是说在模板内部没有错配。

特别是

3’

端，一定要避免连续

4

个以上的碱基互补错配。

③引物序列的

GC 

含量最好在

40

％一

60

％，

且上下游引物序列

GC

含量的差

异不要太大，3’端最后

5

个碱基最好不要富含

GC

，特别是连续

3

个的

G

或

C

。

④DNA

双链形成所需的自由能

AG

，应该以

5’端向

3’端递减，3’端

AG

最

好不要高于

9

．

0 keaf mol[31

。

⑤避免形成稳定的引物二聚体

(Dimer and Cross DimeO 

和发夹结构

(Hairp

in)

，

AG

高于

4

．

5 keal

／

mol

时易引发

上述两种结构的产生。

⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，

最好跨越一个内含子区，

这样便

于对扩增出

来的片段进行功能鉴定和表型分析。

⑦如果以

DNA

为模板设计引物，产物长度在

100

—

600 bp

比较理想。而以

m

RNA

为模板设计引物时，产物长度在

150

—

300 bp

比较理想。

⑧5’

 端对

PCR

影响不太大，

可以引进修饰位点和标记物

[2]

。

只要掌握了

以上原则和注意事项，

我们可以在软件和程序设计的一组引物中筛选出几对我们需要的目标

引物。

Primer Premier 5

和

Oligo 6

可以在

www.bbioo.com/soft/

下载，

primer3

的主页位

置在

http://www.genome.wi.mit.edu

。

2 

引物的二次筛选

引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进

行特异、高效

PCR

扩增的那对引物。本步应注意以下两点，

一是得到的一系列引物分别在

Genebank

中进行回检。

也就是把每条引物在比对工具

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blas

t/) 

的

blastnr

中进行同源性检索，

弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，

也就是有

可能形成错配的引物。

一般连续

10 bp

以上的同源有可能形成比较稳定的错配，

特别是引物

的

3’端应避免连续

5-6 bp

的同源。二是以

mRNA

为模板设计引物时要先利用生物信息学的

知识大致判断外显子与内含子的剪接位点

(

例如

http://CCR-081.mit.edu/GENESCAN.html

的

GENESCAN

工具或者

GeneParser

软

，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。