核酸吸光度、分子量、摩尔浓度之间的相互换算及引物浓度的确定 |
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光度计测量的转换:
双链DNA (ds DNA):A260 = OD260 = 1 相当于50 µg/ml溶液 单链DNA(ss DNA):A260 = OD260 = 1相当于33 µg/ml溶液 RNA:A260 = OD260 = 1相当于40 µg/ml溶液 参考文献:Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536. 核酸分子量计算方程式: 吸光度(A)=摩尔消光系数×浓度×长度 500 bp的双链DNA=325,000 Daltons 500 nt*的单链DNA=162,500 Daltons *nt = nucleotide dNMP的平均分子量=325 Daltons 寡聚体定量: 20-mer,A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体:5 nmol = 33 µg/(20×325) 40-mer,A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体:2.5 nmol = 33 µg/(40×325) pmol为单位的引物转换为µg为单位的引物: (X pmoles×长度bp×325)/ 1,000,000 例:10pmoles的25-mer,则为 (10pmol×25bp×325)/ 1,000,000 = 0.081 µg primer µg为单位的引物转换为pmol为单位的引物: (X pmoles×1,000,000)/(长度bp ×325) 例:0.1µg的20-mer,则为 (0.1µg×1,000,000)/(20bp×325)= 15.4 pmoles primer PCR扩增反应引物浓度的计算: 引物毫摩尔浓度(mM)= pmoles/µl 例1:100µl PCR反应体系中有20pmol的引物 = 0.20 mM 例2:引物为24bp,并溶解于0.1ml µl H2O中; 10µl溶液稀释至1.0ml测定其A260为:A260 = OD260 = 0.76; 则贮存液在260nm(A260)的吸光度为76; 0.1ml的贮存液含有7.6个单位的A260; 引物碱基组成为:A=6, C=6, G=6, T=6; 260nm引物的摩尔消光系数 = a(16,000) + b(12,000) + c(7,000) + d(9,600) 注:a、b、c、d分别是 A's、G's、C's、T's的碱基个数; PCR引物的摩尔消光系数= 6(16,000) + 6(12,000) + 6(7,000) + 6(9,600) = 267,600 则PCR引物贮存液的摩尔浓度为:76/267,600 = 284 mM 引物浓度的确定 一般合成的寡聚体DNA(Oligo DNA)均以OD260来单位来表示的。所谓OD260值是指在1ml体积1cm光径标准比色杯中,260nm波长下吸光度为1 A260的寡聚体DNA溶液被定义为1 OD260。因此,根据此定义,1OD260单位相当于33ug的寡聚体DNA,从而可根据寡聚体DNA的OD260值及其自身分子量来计算得到摩尔数,以计算不同浓度的溶液。 1.寡聚体DNA分子量(MW)的精确算法: 一般而言,寡聚体DNA的精确分子量可根据下述公式进行计算: MW=(A碱基数×312)+(C碱基数×288)+(G碱基数×328)+(T碱基数×303)- 61 例:TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG A=1 C=3 G=11 T=6 MW =(1×312)+(3×288)+(11×328)+(6×303)- 61 = 6541 2.寡聚体DNA分子量(MW)的粗略算法: 由于寡聚体DNA中的每个脱氧核苷酸的平均分子量近似于324.5,因此,一条寡聚体DNA的分子量粗略算法为: MW = 碱基数bp×324.5 粗略算法示例: 1 OD260 的20-mer Oligo DNA,则 分子量 = 20×324.5 = 6490 质量数 = 1×33 = 33ug 摩尔数 = 33/6490 = 0.005umol = 5nmol 3.寡聚体DNA摩尔数的粗略算法: 即1个OD260值的X-mer Oligo DNA摩尔数计算公式为: Y nmol = 33ug ÷(Xbp×324.5) |
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