图 1：saRNA 质粒载体骨架结构和自我复制过程。

2

saRNA 载体序列优化

saRNA 要比非复制的线性 mRNA 超出 7000 多 bp，相比传统非复制线性 mRNA 来说，saRNA 编码靶蛋白实现更高的表达水平和更持久的表达时间，然而，由于宿主天然免疫系统的存在，saRNA 编码靶标蛋白的表达还是会逐渐减弱。近些年来，研究人员尝试各种策略来设计优化 saRNA 载体骨架序列，以 提升 saRNA 表达强度和持续时间，降低宿主天然免疫反应。

2.1

突变 saRNA 序列

2019 年，YingzhongLi 等人基于 VEEV 复制子系统，构建 体外演化策略，延长复制子转染细胞的培养时间，同时 重复富集高表达水平的细胞将会筛选到携带有利突变的复制子，从而找到高表达，低免疫原性的突变复制子序列。很多复制子研究中采用缺乏 IFN 信号途径的 BHK-21 细胞，为筛选到能够有力限制宿主细胞天然免疫反应的复制子，YingzhongLi 等人选择拥有 IFN 信号通路的 Jurkat 细胞。体外转录表达 mCherry 荧光蛋白的 VEEV 复制子，转染 Jurkat 细胞。基于 RNA 病毒突变速率，将转染复制子的细胞培养 60 天，在此期间，借助流式细胞荧光分选技术 （FACS），10 天为一轮，筛选 mCherry 表达量前 20%的细胞。随着每一轮的筛选，mCherry 阳性细胞比例和荧光强度会逐渐增加，到第 6 轮时达到平台值。从筛选到的阳性细胞（第 5 轮）中提取 Total RNA，反转录成 cDNA。用 7 对特异性的引物扩增 NSP1-4 和亚基因组启动子序列，将扩增片段分别克隆到质粒载体上，转化大肠杆菌，挑选克隆子进行测序。

图 2：采取体外演化策略筛选促进亚基因组靶蛋白表达水平的 saRNA 有益突变。

与原始复制子序列比对，发现 NSP2 和 NSP3 位置存在 5 个突变位点。将这些突变位点进行组合，转染细胞，结果发现，位于 NSP2 和 NSP3 序列上面的 2 个突变位点（b1 和 b2）能够增强整个复制子 RNA 和亚基组 RNA 水平，从而增强 mCherry 细胞内的表达强度和持续时间，而位于 NSP3 序列上面的 3 个突变位点(a 和 c1/c2)能够这种增强效应进行调控（不改变或者抑制）。此外，他们还发现，一般来说，b1/b2 位点突变会增强 IFN 信号通路，而 c1/c2 位点突变会减弱 IFN 信号通路。研究人员挑选了两个有效突复制子，采用瘤内注射或者肌肉注射 LNP-突变复制子，在小鼠体内 Luciferase 荧光表达强度和持续时间均明显优于野生型复制子。

图 3:突变 RNA 复制子能够影响靶标基因在小鼠体内表达强度和持续时间。

2.2

分割 saRNA 系统

图 4：设计编码 Luciferase 正链或者负链 RNA Splitzicon 和编码非结构蛋白的 NSP-splitzicon。

2.3

反式 saRNA 系统

在 Robin J. Shattock 工作的基础上 ，2022 年，Ugur Sahin 开发出分割的反式 RNA 复制系统（Trans-amplifying RNA system，taRNA）， 分为 TR 组分和复制酶组分。 TR 组分将编码复制酶的 NSP 基因从 saRNA 序列中剔除掉，保留 5'CSE （保守序列）和 SGP，下游序列包括靶基因序列和 3'CSE。 复制酶组分又可分为两种类型:第一种是标准的 saRNA 序列，只是编码区是无关序列 iTG，这个 saRNA-REPL 只用来递送复制酶，不会编码任何靶蛋白;第二种选择是采用编码复制酶的传统非复制 mRNA (nrRNA-REPL)。

图 5：saRNA-REPL 反式系统与 nrRNA-REPL 反式系统构建策略。

nrRNA-REPL 反式系统要比 saRNA-REPL 反式系统介导的荧光蛋白细胞表达水平高出 10-100 倍，可实现与传统 saRNA 自复制系统类似的高效蛋白表达水平。nrRNA-REPL 反式系统之所以优于 saRNA-REPL 反式系统可能是由于 nrRNA 具有非常高效的复制酶表达效应，而且对细胞整体的翻译不会造成干扰。在小鼠模型中，研究人员采用 50ng 编码 HA 抗原的 nrRNA-REPL 反式系统 b 便可以触发高水平的中和抗体，保护小鼠免受流感病毒触发的死亡。此外，由于复制酶不仅可以复制 RNA，而且还可以对 RNA 拷贝进行加帽和加尾。当省去构建 nrRNA-REPL 时的加帽和加尾反应时，对于其所触发的免疫原性并不会产生太大的影响。

图 6：nrRNA-REPL 反式系统实现与传统 saRNA 自复制系统类似的高效蛋白表达水平。

2.4

共表达干扰素调控因子

为抵抗天然免疫对于细胞翻译的抑制，alphaviruses 核衣壳蛋白基因开放阅读框 5'端会形成 RNA 茎环结构（downstream loop，DLP），从而能够启动独立于 eIF2α翻译。当靶基因取代结构蛋白基因后，saRNA 缺乏 DLP，其翻译过程对 eIF2α磷酸化非常敏感。因为在靶基因前面插入核衣壳开放阅读 5'端的 DLP 序列（102 个核苷酸，编码 34 个氨基酸）可能会改变靶蛋白的功能，因此需要通过其他途径来解除天然免疫对 saRNA 翻译的抑制。

与 alphaviruses 相反，绝大多数其他病毒通过编码大量的反作用于细胞质 RNA 受体的病毒蛋白来实现免疫逃脱。例如，牛痘病毒表达特异性的免疫逃脱蛋白：PKR 抑制剂；dsRNA 结合蛋白 E3；PKR 假底物 K3;IFN 诱饵受体 B18。实际上，很早就有人通过共转染编码牛痘病毒 E3/K3/B18 mRNA 来提升外源合成的非复制 mRNA 的蛋白翻译效率，这种方法早已经在商业上用于生产可诱导多潜能干细胞。有研究曾报道，流感病毒多功能免疫逃脱蛋白 NS1 也有助于增强外源合成的非复制 mRNA 翻译效率。

图 8：在小鼠体内，共递送编码牛痘病毒免疫逃逸蛋白的 mRNA 组合显著增强 saRNA 编码的 Luciferase 表达水平，并且具有剂量效应。

Ugur Sahin 采取的共转递送编码免疫逃逸蛋白 mRNA 的方式不足之处在于 2ug saRNA 需要共递送 6ug 或者 12ug E3 mRNA，这显著增加 RNA 注射剂量，而且，这些大量的反式编码产生的蛋白可能会抑制细胞摄取和表达两种类型的 RNA。在此基础上， 2021 年，Robin J. Shattock 构建顺式编码天然免疫反应抑制蛋白（innate inhibiting proteins，IIPs）的 saRNA 文库， 筛选增强 saRNA 靶标蛋白表达和免疫原性的 IIPs。他们发现 saRNA 通过顺式作用编码产生的副流感病毒 PIV5 蛋白和 MERS ORF4a 蛋白能够提升靶标蛋白在细胞水平和小鼠体内表达量以及编码狂犬病毒 G 糖蛋白 saRNA 在兔子中的免疫原性。非常有意的是，他们还发现 ruxolitinib （JAK/STAT 抑制剂）会显著提升 saRNA 体内靶标蛋白翻译效率。Robin 的工作说明在 saRNA 骨架序列中直接插入编码 IFN 信号通路抑制蛋白的基因能够显著增强 saRNA 蛋白表达水平，降低 saRNA 免疫原性。

图 9：构建顺式编码天然免疫反应抑制蛋白（innate inhibiting proteins，IIPs）的 saRNA 文库，筛选增强 saRNA 靶标蛋白表达效率和降低 saRNA 免疫原性的 IIPs。

3

结论

相比传统的非复制线性 mRNA 而言，saRNA 最大的优势就是进入细胞后可以不断复制编码靶标基因的亚基因组 RNA，以极低剂量实现高水平的靶标蛋白表达。saRNA 质粒骨架序列优化目的是实现高效率和持久性的靶标蛋白表达，降低触发的天然免疫反应强度，沿着这个思路，研究人员采取体外演化 saRNA 序列，切割 saRNA 系统，构建反式 saRNA 以及共表达 IFN 信号通路抑制因子等一系列策略进行不断的尝试摸索，为基于 saRNA 技术的疫苗或者其他疗法的质粒载体序列优化奠定了一定的理论基础。此外，由于编码复制酶复合物的 NSP 基因长达 7000 多 bp，这大大增加 saRNA 在体外转录反应时的难度，降低 saRNA 生产时的产量和纯度。尽管此前 Robin J. Shattock 对合成超长片段 saRNA 的体外转录反应体系做出过优化，但是，未来还需要依赖能够高效合成超长片段的 T7RNA 聚合酶来做出根本性突破。

An Update on Self-Amplifying mRNA Vaccine Development.

In vitro evolution of enhanced RNA replicons for immunotherapy.

Structural Components for Amplification of Positive and Negative Strand VEEV Splitzicons.

A Trans-amplifying RNA Vaccine Strategy for Induction of Potent Protective Immunity.

Innate Inhibiting Proteins Enhance Expression and Immunogenicity of Self-Amplifying RNA.

Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins.

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