图解三代测序(Nanopore) |
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一、测序原理 先介绍 Nanopore 测序中的几位主角: Reader :在自然界中,有一种可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白,具有天然的蛋白纳米孔。经过人为基因工程修饰后,得到的就是 Nanopore 测序所需的 Reader 蛋白。 ![]() Membrane:Reader 蛋白会被嵌入到高电阻率的 Membrane (人工合成的多聚物膜),膜两侧是离子溶液,在两侧加不同的电位,离子就会在孔中流动,形成电流。 ![]() Motor:在 Nanopore 文库构建时,需要在接头上连接一种动力蛋白,用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。以DNA解螺旋酶作为 Motor(动力蛋白)为例,它可以除了可以解开双螺旋,使之变为单链,还可以提供推动力。 ![]() Tether:该蛋白用于锚定DNA或RNA链,防止在溶液中飘动,并使其进入纳米孔中。 ![]() 这时,解开的其中一条链会穿过蛋白质孔,它在通过蛋白孔时,会对膜两边离子的稳定流动产生扰动。不同的碱基,对离子流的影响不同,也就会产生不同的电流大小,进而形成下面的电流信号图。 ![]() 利用这些电流信号,使用计算机软件识别后,推断出碱基类型,完成测序。 二、测序仪介绍虽然 Nanopore 测序仪种类很多,但都是基于Nanopore芯片来搭建的平台,大到由多个芯片阵列组成的PromehION,GridION系列测序仪,小到可以连接手机的Type C,电脑USB的MnION系列便携式测序仪。 ![]() 这里边,最著名的就是MnION系列,2016年8月,美国宇航员凯特·鲁宾斯在国际空间站完成微重力条件的DNA测序。 它在测序时,一般像下图这样连接就行,显而易见的便携性。比如,可以直接用它在深入疫区采集样本后进行实时分析,为防疫工作争取大量宝贵的时间和资源。 ![]() 测序时,将制备好的文库或样本溶液,滴在芯片小孔中,开始测序。 ![]() 一张芯片中有 2048 个 membrane wells,也就是芯片上的一个孔,每个孔包含一个nanopore Reader。 ![]() 每四个 wells 共享一个 Amplifier(信号放大器),一张芯片中有 512 个信号放大器,也就是 512 组 wells。 ![]() 在启动测序仪后,机器自检,会将每组 wells 中依据效率高低排序。测序开始,仪器先用每组 wells 中效率最高的 wells,运行 8 小时后,更换效率第二的,以此类推。 但是,在实际使用过程中,只有 1200 个 wells可以正常工作。 造成 wells 失效的原因: wells 中没有 Reader 蛋白,或纳米孔不通,这时无电信号膜破损,这时有强电信号,不能正常测序在单个 well 中有两个及以上的 Reader 蛋白,电信号互相干扰三、建库方法1、1D 文库1D文库是将DNA双链,解链为正义链与反义链,分别测序,大约有 85% 的碱基判读准确率。 目前1D文库有两种建库方案: 标准建库 将 DNA 打断![]() ![]() ![]() ![]() 下图是 Tether 与接头序列识别及锚定过程 ![]() ![]() ![]() ![]() 在 DNA 两侧接 1 D 2 1D^2 1D2 接头,其他步骤和 1D 文库类似。 这种文库中的 1 D 2 1D^2 1D2 接头,可以让第二链紧跟第一链来一起测序。 由于可以测到两条链,可以相互矫正,进而提高判读准确率,能达到 90%以上的碱基判读准确率。 ![]() 但是,由于文库质量,蛋白活性等因素,导致并不是所有的第一链后都会测到第二链。 四、碱基判读在测序过程中,得到的信号并不是每次测得一个碱基信号。而是根据 Reader 蛋白孔的纵向长度,R9 大约为 5 个碱基长,也就是说,同时会测得 5 个碱基的电信号,这并不是一项简单的判断过程。 目前,Nanopore 公司采用一种机器学习方法,递归神经网络(RNN),对碱基进行判读。 该过程简单来说,是将已知碱基序列的电信号波形图做训练集和测试集,通过修正参数,拿到模型。最后,将新测到的未知序列的波形图与之比对,从而提高判读准确率。 但是,还是有误读情况: 由于空间结构相似性,嘌呤间误读,嘧啶间误读更容易发生。碱基复杂度低的序列(如,polyA序列),更容易误读五、测序影响因素电压以R9芯片为例,测序过程,先用 180 mV 电压,每 10 min,短时间翻转电压方向,作用是激活被堵住或卡住的 Reader 蛋白孔。但是,这个过程也会使正常测序的 DAN链倒吐回去。 随着电极使用时间的增加,电极的电压会发生漂移,因此每过两小时,要增加 5mV 电压抵消影响。 速度与产量R9 芯片,测序速度是 250 碱基/s,一张芯片可以得到约 5 ~ 10 G的碱基序列。 六、芯片版本号Nanopore 公司每一种新芯片就会有新 Reader蛋白,Motor,Membrane 版本号,一般命名规则如下: Reader:R8,R9,R10,等 Motor:E6,E7,E8,等 Membrane:M9,M10,等比如,R9 指的是大肠杆菌的 CsgG 蛋白质改造的 Reader 蛋白。 ![]() 参考: https://www.youtube.com/watch?v=RcP85JHLmnI https://www.youtube.com/watch?v=E9-Rm5AoZGw&t=13s https://www.youtube.com/watch?v=sv9fFeSd3kE https://nanoporetech.com/ |
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