1.载入序列：运行ClustalX，主界面窗口如下所图（图1），依次在程序上方的菜单栏选择“File”－“Load Sequence”载入待比对的序列，如图2所示，如果当前已载入序列，此时会提示是否替换现有序列(Replace existing sequences)，根据具体情形选择操作。

2.编辑序列：对标尺(Ruler)上方的序列进行编辑操作，主要有Cut sequences(剪切序列)、Paste sequences(粘贴)、Select All sequences(选定所有序列)，Clear sequence Selection(清除序列选定)、Search for string(搜索字串)、Remove All gaps(移除序列空位)、Remove Gap-Only Columns(仅移除选定序列的空位)

3.参数设置：可以根据分析要求设置相对的比对参数。通常情况下，我们可以使用默认参数。比对参数主要有六个，分别是Reset New Gaps before Alignment(比对前重置新的空位参数)，Reset All Gaps before Alignment（比对前重置所有空位参数），Pairwise Alignment Parameters（两两序列比对参数），Multiple Alignment Parameters（多重序列比对参数），Protein Gap Parameters（蛋白空位参数），Secondary structure Parameters（二级结构参数），如图4所示：

修改参数只需点击相应标签，示例比对的是多序列比对，故可选择“Multiple Alignment Parameters”弹出参数设置窗口，如图5所示：

4.完全比对：返回菜单栏选择“Complete Alignment”标签，此时会弹出输出文件路径的设置窗口，设置Guide Tree File（向导树或指导树文件）、Alignment File（比对文件）的保存位置（存放路径），点击“Align”按钮程序自动开始序列的完全比对，比对所需时间因序列文件大小和长度、计算机性能而异，如图6-8所示：

当主界面的左下状态栏会提示“CLUSTAL-Alignment File created []”时说明比全完毕，这时文件保存位置的目录下会生成生成两个文件，分别是*.aln和*.dnd，aln是序列比对的文件，可以进一步用于构树系统发育树，dnd是向导树文件（指导树），这两个文件可以用Windows系统中的“记事本”或第三方程序“UltraEdit”等打开，如：

5.后续分析： 　　1)Clustalx比对生成的结果可读性不是太好，一般需要专业的序列着色软件处理，如Boxshade、ESPript，这两个工具都是在线进行，其中Boxshade图解教程详见本Blog日志。 Boxshade在线网址：http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html ESPript在线网址：http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi 　　2)转换ALN文件，进一步构建系统发育树，转换格式依不同软件而有所不同，如在PHYLIP分析前需要将ALN格式转换为PHY格式方可...

注意事项： 1)dnd是向导树文件，可以用TreeViews软件查看树图。注意：向导树不是系统发育树，两者区别敬请关注近期－系统发育分析专题。 2)多重比对文件推荐要求为规范的FASTA格式，文件扩展名不限，格式大致如下：