免疫组化的方法很多，新方法层出不穷，虽然这些方法各有其特色，但总的来说，只要应用恰当均可获得较为满意的结果。方法的选择并不是影响免疫组化结果的主要因素。

　　1.石蜡切片脱蜡至水：(石蜡切片染色前应置 60℃ 1 小时) 。

　　① 二甲苯 、II，各 10 分钟。

　　② 梯度酒精：100%，2 分钟 95%，2 分钟 80%，2 分钟 70% 2 分钟。

　　③ 蒸馏水洗：5 分钟，2 次(置于摇床)。

　　2.过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2 O2 ，室温 10 分钟(避光) 。

　　3.蒸馏水洗：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

　　4.抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。

　　附：抗原修复液(10mMpH 6.0 枸橼酸钠缓冲液)的配制：① 储备液的配制：A 液：枸橼酸三钠- 2H2O 29.41g + 蒸馏水 1000ml;B 液：枸橼酸 21g + 蒸馏水 1000ml;② 工作液的配制：A 液 82ml+ B 液 18ml+ 蒸馏水 900ml

　　抗原修复的方法： ① 高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液(10mM，PH6.0)，淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽 3 分钟后缓慢冷却(可用自来水在高 压锅外冲，以助冷却) 。②微波处理技术：用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸 钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5 分钟;取出并补充已预热的 枸橼酸钠缓冲液; 再选择中高或高档，5分钟(.佳温度为 92 95℃)③ 酶消化处理。

　　抗原修复的注意事项：① 组织不能干。 ② 选择抗原修复方法要因抗体而异。 ③ 该方法主要用于 10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④ 抗原修复后至 DAB 显色的过程中，均需用 PBS 缓冲液。

　　5.PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

　　6.正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 (保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清 (与第二抗 体 同源动物血清)处理，37℃，15 分钟。

　　附：正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每张切片需要量按 50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。

　　7.滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2 小时(也可置于 4℃冰箱过夜) 。

　　8.PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

　　9.滴加生物素化的二抗，37℃，40 分钟。

　　10.PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

　　11.滴加三抗 (SAB 复合物) ，37℃，40 分钟。

　　12.PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

　　13.DAB 显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止) 。

　　附：DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成 1ml，100μl，50μl ，20μ l 等，-20℃，冻存。② 工作液：DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

　　14.自来水(细水)充分冲洗。

　　15.苏木素复染，室温，30 秒，自来水冲洗。

　　16.自来水冲洗返蓝，15 分钟。

　　17.梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。

　　18.二甲苯透明：I ，II (二甲苯)各 5 分钟

　　19.封片：加拿大树胶(或中性树胶)封片。

　　1、组织的采集、固定和保存：

　　采取组织后，

　　方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4°C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜

　　方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis）

　　PBS缓冲液洗三次，每次5min，4°C保存于70%乙醇中。

　　2、组织的包埋、切片、展片及保存：：

　　固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54°C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10mm，贴于处理过的干净载玻片上，37°C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。

　　石蜡包埋：

　　保存于4°C 70%乙醇中的组织样品

　　80%乙醇 15 min

　　95%乙醇 15 min

　　100%乙醇 15min ´ 2

　　1/2乙醇1/2二甲苯 15 min

　　二甲苯透明 5-10 min

　　1/2二甲苯1/2石蜡 30 min

　　石蜡（1） 1.5hr

　　石蜡（2） 1.5-2.5hr

　　石蜡（3） 包埋

　　RT保存

　　3、石蜡组织切片的免疫组化方法：

　　密封保存于RT的组织切片

　　二甲苯(1) 20 min

　　二甲苯(2) 20 min

　　100%乙醇 20min

　　95%乙醇 10 min

　　80%乙醇 10 min

　　通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈

　　切片在PBS中浸泡 5 min*2

　　0.4%Tritonx RT 10 min

　　切片在PBS中浸泡 5 min*3

　　3%H2O2 RT 10min

　　切片在PBS中浸泡 5 min*3

　　0.25%胰酶 RT 10min

　　切片在PBS中浸泡 5 min*3

　　Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min

　　倾去blocking buffer，勿洗

　　一抗4°C overnight in blocking buffer

　　取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3

　　二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h

　　切片在PBS中浸泡 5 min*3

　　DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）

　　如果是增强型DAB只要1min即可。

　　切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s，

　　玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。

　　若颜色太深，可用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟（或更久）

　　脱水85%乙醇 5 min

　　95%乙醇 5 min

　　无水乙醇 5 min

　　无水乙醇 5min

　　二甲苯(1) 10min

　　二甲苯(2) 10min

　　中性树胶封片，室温干燥保存

　　4、石蜡组织切片的免疫荧光方法：

　　密封保存于RT的组织切片

　　二甲苯(1) 20 min

　　二甲苯(2) 20 min

　　100%乙醇 20min

　　95%乙醇 10 min

　　80%乙醇 10 min

　　通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈

　　切片在PBS中浸泡 5 min*2

　　0.4%Tritonx RT 10 min

　　切片在PBS中浸泡 5 min*3

　　切片在PBS中浸泡 5 min*3

　　0.25%胰酶 RT 10min

　　切片在PBS中浸泡 5 min*3

　　Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min

　　倾去blocking buffer，勿洗

　　一抗4°C overnight in blocking buffer

　　取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3

　　荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1：1000，GAM-488 1：1000RT 1h

　　DAPI（1：1000请根据二抗说明稀释二抗）

　　切片在PBS中浸泡 5 min*3

　　moil封片，避光4°C保存