NF

2023-06-02 06:33| 来源: 网络整理| 查看: 265

NF-κB (Nuclear factor-κB) 作为一种核转录因子能够与多种基因启动子区的特定核苷酸序列结合从而启动下游基因转录，在免疫、炎症、氧化应激、细胞增殖与凋亡等生理病理过程中起重要调控作用[1]。NF-κB蛋白家族包括p50、p52、p65 (RelA)、RelB、c-Rel 五个亚基，其功能状态通常为这些亚基形成的同源或异源二聚体，其中最常见的NF-κB二聚体为p65与p50组成的异二聚体。在胞浆中，这些NF-κB二聚体常常以与IκB结合的形式存在，处于非活性状态，在上游信号促使IκB降解后进入细胞核参与下游基因的表达调控。另外胞浆中还存在一些非活性的NF-κB前体蛋白二聚体。这些前体蛋白通过非经典途径剪切成相应有活性的NF-κB二聚体，进而入核参与下游基因的表达调控[2-3]。研究表明，人体许多疾病如阿尔兹海默症、糖尿病、风湿性关节炎、哮喘及一些癌症等均与NF-κB的失调相关[4-10]，因此，NF-κB蛋白家族及其在人类疾病的发生发展与预防治疗中所扮演的角色等一直是研究的热点。

报告基因 (Reporter gene) 是一种编码易于被检测的蛋白质或酶的基因。该基因序列可以插入到基因表达调节序列 (如启动子、增强子) 之后形成嵌合基因，或与其他目的基因序列相连接形成融合蛋白的基因序列，进而通过检测该报告基因的表达来定性或定量测定目的基因的表达情况。常用的报告基因有氯霉素转乙酰酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶以及荧光蛋白等[11]。本实验室选用的NanoLuc (NLuc) 是一种人工改造的荧光素酶，其分子量小 (19.1 kDa，171个氨基酸)，热稳定性高，没有翻译后修饰或二硫键；其发光强度与萤火虫荧光素酶或海肾萤光素酶相比强100倍，且其反应不依赖ATP[12]。这些优点使得NLuc成为目前较理想的报告基因之一。

本实验室期望通过对现有逆转录病毒载体的改造，构建一种新的含有NF-κB增强子序列和NLuc报告基因序列的表达载体，并进一步构建受NF-κB调控的稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系。该细胞系可被用于NF-κB活化状态定量检测和与NF-κB活化调控相关的药物的筛选之中。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、细胞株和质粒

感受态大肠杆菌 Escherichia coli DH5α购自天根生化科技 (北京) 有限公司；人胚肾上皮包装细胞GP2-293、人宫颈癌细胞系HeLa由本实验室保存；pQCXIP载体购自Clontech公司；NF-κB增强子序列、NLuc序列及TATA box序列由北京普尔普乐生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶、连接酶购自Fermentas 公司；肿瘤坏死因子TNF-α购自Peprotech公司；雷公藤甲素 (Triptolide) 购自南通飞宇生物科技有限公司；腔肠素购自Sigma公司；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自天根生化科技 (北京) 有限公司；DMEM培养基购自Gibco公司、胎牛血清购自HyClone公司。

1.2 方法 1.2.1 逆转录病毒载体pQCXIP-NF-κB-NLuc的构建及其鉴定

逆转录病毒载体pQCXIP原有CMV启动子的去除、NF-κB增强子和TATA box序列的装入，以及荧光素酶NLuc基因序列的装入如图 1所示。首先将pQCXIP利用Bgl Ⅱ、Age Ⅰ进行双酶切，去除pQCXIP原有CMV启动子，然后将合成的含有转录因子NF-κB增强子和TATA box序列 (序列如表 1所示，两端含有Bgl Ⅱ和Age Ⅰ的酶切位点) 的DNA片段经Bgl Ⅱ、Age Ⅰ双酶切装载入改造后的pQCXIP质粒上。NanoLuc (序列如表 1所示，两端含有Age Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位点) 与上述得到的pQCXIP-NF-κB质粒分别用Age Ⅰ、EcoR Ⅰ进行双酶切，连接并转化获得重组的逆转录病毒载体pQCXIP-NF-κB- NLuc。本实验合成的NanoLuc序列的N端部分含有分泌信号肽，可帮助蛋白分泌到细胞外的培养基中。同时，我们构建了去除NF-κB增强子 (保留TATA box) 的质粒pQCXIP-TATA- NLuc作为对照载体。构建的质粒经华大基因测序表明序列正确。

图 1 pQCXIP-NF-κB-NLuc的构建示意图 Figure 1 Schematic representation of the construction of pQCXIP-NF-κB-NLuc plasmid. 图选项表 1 NF-κB-TATA box和NanoLuc序列 Table 1 Sequence of NF-κB-TATA box and NanoLuc Sequence name Size (bp) Sequence NF-κB- TATA box 1 AGATCTGGGA ATTTCCGGGA ATTTCCGGGA ATTTCCGGGA ATTTCCTTAA 51 TTAAAGACTC TAGAGGGTAT ATAATGGAGC CAATGACAAG ACGCTGGGCG 101 GGGTTTGTGT CATCATAGAA CTAAAGACAT GCAAATATAT TTCTTCCGGG 151 GACACCGCCA GCAAACGCGA GCAACGGGCC ACGGGGATGA AGCAGCGAAG 201 AAATCTGCAC TCGACGGTAG CGCGGGACCG GCATCCACCG GT NanoLuc 1 ACCGGTCGCC ACCATGAACT CCTTCTCCAC AAGCGCCTTC GGTCCAGTTG 51 CCTTCTCCCT GGGCCTGCTC CTGGTGTTGC CTGCTGCCTT CCCTGCCCCA 101 GTCTTCACAC TCGAAGATTT CGTTGGGGAC TGGCGACAGA CAGCCGGCTA 151 CAACCTGGAC CAAGTCCTTG AACAGGGAGG TGTGTCCAGT TTGTTTCAGA 201 ATCTCGGGGT GTCCGTAACT CCGATCCAAA GGATTGTCCT GAGCGGTGAA 251 AATGGGCTGA AGATCGACAT CCATGTCATC ATCCCGTATG AAGGTCTGAG 301 CGGCGACCAA ATGGGCCAGA TCGAAAAAAT TTTTAAGGTG GTGTACCCTG 351 TGGATGATCA TCACTTTAAG GTGATCCTGC ACTATGGCAC ACTGGTAATC 401 GACGGGGTTA CGCCGAACAT GATCGACTAT TTCGGACGGC CGTATGAAGG 451 CATCGCCGTG TTCGACGGCA AAAAGATCAC TGTAACAGGG ACCCTGTGGA 501 ACGGCAACAA AATTATCGAC GAGCGCCTGA TCAACCCCGA CGGCTCCCTG 551 CTGTTCCGAG TAACCATCAA CGGAGTGACC GGCTGGCGGC TGTGCGAACG 601 CATTCTGGCG TAAGGCCGCG ACTCTAGAGT CGGGGCGGCC GGCCGCTTCG 651 AGCAGACATG ATAAGATACA TTGATGAGTT TGGACAAACC ACAACTAGAA 701 TGCAGTGGAA TTC 表选项 1.2.2 质粒转染与病毒制备

人胚肾上皮包装细胞GP2-293用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2条件下培养、传代。构建的pQCXIP-NF-κB-NLuc质粒及对照质粒pQCXIP-TATA-NLuc与pVSV-G病毒包装质粒利用lipofectamine 2000转染试剂按操作说明共转染入GP2-293细胞，其中质粒与lipofectamine 2000质量体积比在预实验后选用转染效果较好的1∶2。转染5 h后培养基更换成新鲜DMEM+10% FBS完全培养基继续培养，48 h后收集含病毒上清，经0.45 μm滤膜过滤，分装。

1.2.3 病毒侵染

人宫颈癌细胞HeLa以2×105/孔接种于6孔板中，在DMEM+10% FBS培养基，37 ℃、5% CO2条件下培养。24 h后，将上述制备的含病毒上清1 mL与2 mL新鲜完全培养基及polybrene (8 μg/mL) 加至HeLa细胞，并于32 ℃、1 800×g (Beckman Allegra X15R) 水平离心机中离心 90 min，37 ℃静置5 h，再更换成新鲜DMEM+10% FBS培养基继续培养。

1.2.4 稳定表达单克隆的筛选

病毒侵染48 h后，HeLa细胞中加入3 μg/mL嘌呤霉素 (Puromycin) 进行筛选。24 h后将嘌呤霉素浓度降低到1 μg/mL维持抗性。4 d后，将存活细胞计数并按1个细胞/孔分配至96孔板中。两周后，将其中的单克隆细胞株继续放大培养。所获得的细胞株记为PP-NF-κB- NLuc-HeLa以及PP-TATA-NLuc-HeLa。

1.2.5 稳定表达细胞系有效性验证

将上述获得的稳定表达细胞分别进行细胞计数，以2×104/孔加入96孔板中。24 h后加入NF-κB信号通路的刺激物肿瘤坏死因子TNF-α，浓度分别为0、5和10 ng/mL，每组设5个复孔。加药24 h后，取培养基上清，加入3 μmol/L底物腔肠素 (Coelenterazine)，使用化学发光仪 (BioTek Synergy 2) 检测发光值。此外，针对PP-NF-κB-NLuc-HeLa细胞系进行了0.1、0.5和2.5 ng/mL三个浓度的TNF-α分别刺激3、6、9、12和24 h的效果检测。

1.2.6 阳性药物雷公藤甲素的抑制

稳定表达的PP-NF-κB-NLuc-HeLa细胞系计数，以2×104/孔加入96孔板中。24 h后加入2.5 ng/mL TNF-α (除空白组) 刺激8 h，再分别加入0、0.25、1、4 ng/mL雷公藤甲素共刺激12 h，取培养基上清检测发光值。

2 结果与分析 2.1 pQCXIP-NF-κB-NLuc质粒的构建

理论上逆转录病毒载体pQCXIP的CMV启动子部分的长度为 (680 bp)。在本研究中，pQCXIP经BglⅡ、AgeⅠ双酶切后，琼脂糖电泳结果表明 (图 2A)，680 bp位置处出现一条明显的核酸条带，而其上的核酸条带位置与理论去除CMV启动子部分的pQCXIP位置 (6.5 kb) 相近，因此可以判断获得了去除CMV启动子的逆转录病毒载体pQCXIP。接下来我们将BglⅡ、Age Ⅰ双酶切后的NF-κB增强子/TATA box序列与改造的pQCXIP进行连接和转化。利用Bgl Ⅱ、Age Ⅰ双酶切鉴定表明 (图 2B)，双酶切得到的核酸条带与理论插入的NF-κB增强子/TATA box序列条带 (242 bp) 大小吻合，说明已构建获得重组质粒pQCXIP-NF-κB。随后将NLuc与重组质粒pQCXIP-NF-κB经Age Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切、连接和转化，并经Bgl Ⅱ、EcoR Ⅰ双酶切鉴定(图 2C)，结果表明NLuc序列被成功插入pQCXIP-NF-κB中，获得了目标质粒pQCXIP- NF-κB-NLuc。该质粒经测序证明序列完全正确。

图 2 pQCXIP-NF-κB-NLuc重组质粒的构建及鉴定 Figure 2 Construction and identification of the recombinant plasmid pQCXIP-NF-κB-NLuc. (A) Bgl Ⅱ,Age Ⅰdigestion result of pQCXIP plasmid. (B) Identification of recombinant plasmid pQCXIP-NF-κB digested by Bgl Ⅱ,AgeⅠ. (C) Identification of recombinant plasmid pQCXIP-NF-κB-NLuc digested by Bgl Ⅱ,EcoRⅠ. 图选项 2.2 NF-κB-NLuc稳定表达细胞系的构建

随后，将构建的pQCXIP-NF-κB-NLuc质粒与pVSV-G病毒包装质粒共转染GP2-293细胞获得逆转录病毒，并将该病毒侵染HeLa细胞。经过嘌呤霉素筛选及单克隆分离，成功地获得了NF-κB-NLuc单克隆稳定表达细胞系。按同样方案也成功地获得了对照组细胞TATA-NLuc单克隆稳定表达细胞系。两组细胞系在加入NF-κB信号通路的刺激物TNF-α刺激24 h后进行了NLuc酶活性检测。结果表明 (图 3)，在5 ng/mL和10 ng/mL TNF-α作用下，NF-κB-NLuc组细胞上清中的酶活性上升，分别为0 ng/mL TNF-α组细胞酶活性的6和11倍，差异有统计学意义 (*P

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