差异分析的原理就是判断组间（处理）差异是否显著大于组内（误差）差异。比如两组样本，高浓度镉离子处理的拟南芥，和正常对照（没有处理）的拟南芥，每组三个植株。由于不同个体间会有个体差异，那么如何判断基因表达差异是由个体间差异导致的还是处理导致的？这就涉及到组间差异和组内差异的比较了。一般差异分析软件如edgeR、DESeq的原理就是比较组间差异和组内差异。所以说通常情况下，如果没有重复，则组内差异无法计算，这就是为什么我们一直强调要有生物学重复样本的原因。但是软件在没有重复样本的时候也可以计算组内差异，是通过公式预估或者人为预设误差差异的。所以说现在不管有没有重复样本，都是可以进行差异分析的，只是有重复样本的话，才能准确估算个体差异带来的误差，差异分析结果才会更准确。 基于R语言进行差异分析的包有很多个，本次详细介绍使用limma（Linear Models for Microarray Data）进行差异分析。

原理： limma 最初是针对基因芯片数据开发的，但后来也被应用于 RNA 测序数据。limma 基于线性模型，使用加权最小二乘法来估计基因表达的差异，并通过贝叶斯方法来校正多重检验问题。limma 通常假设基因表达数据服从正态分布，在处理大规模数据时表现出色，适用于高通量数据分析，如芯片和大规模RNA测序数据，能够很好地控制假阳性率。

limma也是广义线性模型的一种，其对每个gene的表达量拟合一个线性方程。limma的分析过程包括ANOVA分析、线性回归等。 limma对每个gene拟合出这样一个方程，其中： X可以是：

β \beta β 是limma将要求出的值 ϵ \epsilon ϵ 是假定在整个数据集中正态分布的残差(residual)

差异分析是两两数据集间的比较，一个是对照组样本(CK)，一个是处理组样本(Treat)。