转录组已经是十分普及的组学手段，通过也通常是组学的入门技术，但是对于大多数初学者来说，还是会有许多问题。上一期我们重点解析了转录组上游的一些常见问题，今天我们进一步升级，让我们来看看转录组常见问答第二弹！！

Q1

什么是主成分分析？

A1：主成分分析（PCA）是设法将原来众多具有一定相关性（比如P个指标），重新组合成一组新的互相无关的综合指标来代替原来的指标。简单的说是通过多元降维的方式，在保留差异的基础上尽量减低数据维度，从而更简略的描述数据集之间的相对关系，在转录组中PCA可以作为评估组间、组内差异的有效手段，通过离散程度来判断试验设计是否初步符合预期。

Q2

什么是相关性分析？

A2：相关性分析是根据样本之间整体基因表达水平来进行的分析，也是反映样本间相似程度的一种方式，数值越接近1则说明样本间相似度越高、数值越解决0则说明相似度越低。对于相关性的计算基本是三种方式：Pearson相关系数,Kendall相关系数和Spearman相关系数，其中在转录组学中被普遍使用的是 Pearson系数。

Q3

什么是富集分析？

A3：“富集”（enrichment）通常指使用某种方法使目的物质占比增加，如富集某种细胞或蛋白，同理，“功能富集分析”可理解为在差异基因集中寻找占比高的功能，从而了解差异基因集的关键功能，进而推出样本间重要的功能差异。转录组中最常见的富集分析是GO富集分析和KEGG富集分析，二者的富集方法为Hyper-geometric distribution，一般选取Q-Value≤0.05为显著富集。

Q4

转录组常用数据库有？

A4：一般有NR/NT、GO数据库、KEGG数据库、KOG数据库、Swiss-Port数据库；，NR/NT数据库常用于蛋白质同源性分析和序列比对；GO数据库可以为基因功能注释和基因表达分析提供帮助；KEGG数据库可以为研究提供功能基因组学、系统生物学、代谢途径、疾病等方面的信息；KOG/COG数据库可以用来研究基因在不同物种之间的演化和功能差异；Swiss-port则可以运用于蛋白质结构、功能及相互作用等研究领域。大家可以查看转录小白日志丨关于数据库的那些事儿

Q5

什么是可变剪接？

A5：可变剪接是指在基因表达的过程中，通过不同的剪接方式产生不同的mRNA转录本。基因组中的大部分基因包含多个外显子（exon）和内含子（intron）。在转录过程中，基因的前体mRNA（pre-mRNA）会通过剪接机制将内含子剪除，将外显子连接起来形成成熟的mRNA转录本。即一个基因通过不同的剪切模式从而形成了不同的转录本，进而实现不同功能。

Q6

关注的基因在富集结果中没有查到怎么办？

A6：无论是GO还是KEGG富集分析，都是基于GO和KEGG数据库进行，需要首先明确基因是否在数据库中存在注释，在数据库没有注释则必然无法富集；其次富集分析是基于差异基因进行，因此需要其判断为差异；如存在注释但是为非差异基因就需要考虑是否进行差异调参。

Q7

关注的通路在富集图中没有展示是为什么？

A7：KEGG富集分析根据各个通路的显著性筛选，如通路未显著富集，则不会出现在显著富集图例中，同时图例只会展示前30条通路，因为数量受限也有可能并未在图中展示。

Q8

关注的通路不是显著富集通路怎么办？

A8：是否显著富集主要取决于该通路中差异基因占比，若差异基因过少，则很可能导致未显著富集；同时富集分析依然会通过Q值筛选，因此可以考虑是否进行调参放宽筛选标准。当然放宽标准可能会影响结果的可信度，可以结合生物学故事综合考虑。

Q9

基因在两个样本间Count差异较大，但是不是差异基因是为什么？

A9：差异基因的计算是基于统计学方法进行，并不通过直观差值判断，readcount受不同测序深度影响会存在偏差，在分析中会进行数据标准化从而消除影响，同时如果涉及组间分析，这组内重复的情况也会影响到差异基因的判断。

Q10

差异P值和富集P值有什么关系？

A10：差异p值：在差异结果中pvalue为显著性检验的p值，计算模型为负二项分布，padj为多重假设检验校正后的p值，计算方法为BH，pvalue、padj代表的是显著差异的阈值。

富集p值：在富集结果中pvalue为显著性检验的p值，计算原理为

padj为多重假设检验校正后的p值，计算方法为BH，pvalue、padj代表的是显著富集的阈值。差异的p值与富集结果中p值代表的含义不同，同时两个分析中pvalue的计算方式不一致，两者没有任何联系不能混淆。

本期十问十答重点在转录组分析起始阶段，后续问答将会围绕转录组后续分析进行让我们敬请期待~