双重筛选的方法则将细胞同时转入两个分别带有不同筛选标记质粒，将细胞转染后用MTX和MSX同时加压筛选。用这种方法筛选出的细胞克隆的产量相比单一方法要高，如下图1所示。

细胞株基因工程改造

为提高生产细胞株稳定性及其产品质量，人们采取了很多基因工程的手段对细胞株进行改造。比如，过表达半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶、N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅲ可以提高目的蛋白糖基化水平。过表达一些抗凋亡的基以提高细胞在压力环境下的生存能力，延长细胞培养时间。为克服基因重组的位置效应，利用定点重组系统是Cre/loxP系统和Flp/FRT系统，将外源基因定点整合至转录活跃区。所有的这些努力与尝试均是为了能够更高效的筛选出高表达的细胞株，同时为了后期工艺开发缩短时间。

平台工艺开发

生物制药平台工艺开发通常分为前期和后期两个阶段（如图2）。前期工艺开发的目的是快速的开发工艺以产生用于动物毒理学研究的材料及临床1期的样品。利用成熟的平台工艺，可以加快前期工艺开发的进程，例如克隆筛选、工艺锁定等。但是在产品进入临床阶段后，往往需要进一步优化生产工艺，以提高产品的产量、保证生产工艺的稳定性等。无论是前期还是后期开发过程中，如果工艺发生改动，都需要严格监控产品的质量和相似性。

克隆筛选

在细胞培养工艺开发过程中，最终生产细胞株的确定被认为是最重要的步骤之一。如果在后期工艺开发阶段更换细胞株，产品的相似性以及相关临床研究都需要重新验证。因此尽早的确定合适的克隆显得特别的重要。这就需要在前期筛选阶段去模拟后期的大规模生产条件和检测产品质量（表2），以确保筛选出最优的克隆。同时，细胞株的稳定性也是一个重要的筛选因素。

培养基和补料流加工艺开发

哺乳动物细胞对营养的需求差别很大，即使基于同一宿主细胞所构建的不同克隆，其代谢特点与营养需求也不尽相同。因此，在培养基的开发过程中需特别强调“个性化培养基”的概念，即：生产细胞系所使用的培养基应根据其代谢特点进行优化、定制。在培养基开发过程中常用到以下几种方法：（1）组分滴定法；（2）消耗组分分析法；（3）培养基混合法。于此同时，进行培养基优化时不仅需要考虑单一组分的影响，还要关注组分间可能存在的交互作用，这就使得培养基优化成为耗时且复杂的工作。还有一种较好的策略就是将培养基成分首先分成若干“亚类”，针对“亚类”进行筛选和组合，而后针对“亚类”内组分进行详细优化。

流加培养基的开发最简单的做法是直接浓缩基础培养基，同时考虑培养过程中的营养消耗、副产物生成、细胞生长速率与蛋白产量平衡等复杂因素，针对性设计培养基以及补料流加策略。

细胞培养的工艺放大

细胞培养工艺的放大与转移过程中，首先应保证工艺变更前后细胞活性、产物收率以及产品质量等主要技术指标维持不变。培养工艺放大原则多采取非体积依赖参数保持不变（温度、溶氧、pH等），体积依赖参数（工作体积、流加体积、通气量等）线性放大。同时还要考虑溶氧供应和二氧化碳的去除等因素是否满足培养工艺的要求。

细胞培养工艺表征与工艺验证

产业化阶段需要对细胞培养工艺进行充分的定性研究。对诸多工艺参数（接种量、培养温度、pH、DO等）进行风险排序，确定关键工艺参数及操作范围。此外，细胞培养工艺满足药物上市评审要求还需有生产规模的实验数据进行支撑，即所谓的“工艺验证”。FDA和EMEA分别要求连续3或5批连续的生产规模试验数据，并以此为“生物制品许可申请”（BLA）文件的重要内容。

结语与展望

在过去的二十多年里，细胞培养技术得到了快速发展。目前的细胞培养工艺开发，已经从简单的工艺参数优化，进入系统的组学研究深度。同时，业内随着“QbD”理念的深入，越来越多的“过程分析技术（PAT）”开始应用于细胞培养过程，旨在通过加强关键过程参数的监控来确保蛋白药物的最终质量。这些日益成熟的技术为生物药品的研发提供更为有利的支撑。

参考文献：Li, F., et al. (2010). MAbs 2(5): 466-479. PMID:20622510

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