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作者：

乃门塔娜

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摘要：

毛囊是一个动态的微小器官.它不仅具有预防皮肤组织受损,感觉和免疫防护等重要功能,且获取方便.毛囊组织中含有与自我更新,分化,调控毛发生长相关的多种干细胞,维持着皮肤的体内平衡.而毛囊的发生和再生都离不开毛囊干细胞.毛囊干细胞的生物学研究日渐成为毛囊领域,皮肤学领域,再生医学领域的前沿.转录因子Sox9,在胚胎发育,三胚层分化,胚胎干细胞和多种成体干细胞的维持,先天性疾病等重要的生物学过程中具有重要的功能.近几年发现,在早期胚胎生发板形成和毛囊发生中,Sox9有着至关重要的作用.目前,国际上对小鼠和人的毛囊干细胞研究较多,对家畜动物毛囊干细胞的研究甚少.在本研究中,我们首次在体外分离鉴定了阿尔巴斯绒山羊毛囊干细胞(gHFSCs),并对其进行了多能性分析;初步验证了Sox9在gHFSCs中的功能;并且进行了Sox9染色质共沉淀(ChIP),以期研究其在gHFSCs中的作用机制,为今后绒山羊毛囊生长及其调控机理的研究提供实验材料和依据.一,阿尔巴斯绒山羊毛囊干细胞(gHFSCs)的体外分离培养及鉴定我们利用组织贴壁培养法在体外分离gHFSCs,对其进行纯化.从细胞形态,特异标记,增殖能力,体外分化能力等方面对其进行了鉴定.结果显示:实验所得到的细胞较小,呈典型的鹅卵石样,折光度高且贴附能力强,符合毛囊干细胞的形态特征,且在体外培养至20代未出现明显形态变化.免疫组化染色显示,gHFSCs阳性表达毛囊干细胞标记分子Krt15,Krt19,CD34,Itgβ1和Krt14.CD34在gHFSCs中FACS(fluorescence-activated cell sorting)阳性率为99.8%.从细胞生长曲线可以看出,分离得到的gHFSCs具有较强的增殖能力.在转录水平上Krtl4和CD34高表达(p0.01),分别为绒山羊角质细胞的39.68倍和24.37倍,Krtl5的表达量为5.62倍,Itg β1表达量低(p0.01),为1.81倍.同样Western blot检测到了以上特异标记蛋白在gHFSCs中表达.体外成骨诱导后,Von Kossa法染色呈阳性;成软骨诱导阿尔新蓝染色为阳性;成肌诱导后Hoechst33342染色观察到细胞融合现象,免疫组化染色检测到成绩诱导细胞MyoG表达呈阳性.二,阿尔巴斯绒山羊毛囊干细胞(gHFSCs)的多能性分析我们对gHFSCs中与干细胞多能性建立和维持及自我更新能力相关的几个因子Oct4,Nanog,Sox2,AKP和TERT等,通过细胞免疫组化,FACS,Q-PCR和Western blot的方法进行了的检测.结果表明:细胞免疫组化染色显示Oct4,Nanog,Sox2,AKP和TERT等五个因子均在gHFSCs中阳性表达;Oct4,Nanog和Sox2在gHFSCs中FACS阳性率在99.9%以上;与阿尔巴斯绒山羊脂肪间充质干细胞(gADSCs)对比,在转录水平上,gHFSCs中Oct4高表达,为对照细胞的41.36倍;Nanog,AKP,TERT中等表达,分别为对照组的5.61倍,2.74倍和2.10倍(p0.01);在蛋白水平,Oct4,Nanog,AKP和TERT的相对表达量,分别为对照组的5.94倍,10.78倍,1.33倍和1.39倍.Sox2在gHFSCs中mRNA和蛋白水平均表达,而在gADSCs中均不表达.三,Sox9在阿尔巴斯绒山羊毛囊干细胞(gHFSCs)中的功能验证通过毛囊(gHF)冰冻切片和细胞免疫组化,Q-PCR. Western blot检测Sox9在gHF和gHFSCs中的表达;利用shRNA载体,干扰gHFSCs中Sox9的表达,对与细胞增殖分化相关基因进行转录水平和蛋白水平表达变化的检测;对gHFSCs特异标记和干细胞多能因子在转录水平和蛋白水平的表达变化进行检测;钙诱导培养后,对gHFSCs中Sox9和Loricrin(Lor)的表达变化进行检测.结果显示:Sox9在gHF整个外根鞘部位都有表达,在隆突部表达比其他部位强,在毛母质中也有少量表达,既Sox9主要在隆突部集中表达;在体外培养的gHFSCs呈Sox9阳性,在细胞质和细胞核内都有不同程度的表达;Q-PCR和Western blot进一步验证了Sox9在gHFSCs中的转录水平和蛋白水平的表达.Sox9-shRNA的干扰效率达到了53.58%.干扰Sox9表达之后:细胞增殖缓慢,无法进入对数生长期,随着生长周期,凋亡细胞增多;流式细胞术检测细胞周期发现,干扰Sox9表达后的gHFSCs无法完成从S期到G2/M期的过渡;Q-PCR检测与对照组相比发现,p21和细胞核抗原PCNA的表达量显著减少(p0.01),p53表达无显著差异(p0.05),皮肤细胞终末分化标记Lor表达量显著增加(p0.01); gHFSCs不仅失去了毛囊干细胞形态特征,其特异标记Krt15, Krt19,Krt14,CD34和Itgβ1在mRNA水平和蛋白水平的表达量均大幅降低(p0.01);与干细胞多能性和自我更新能力相关的因子Oct4,Nanog,Sox2, AKP和TERT的表达量在转录水平和蛋白水平表达量均急剧减少(p0.01);低钙培养的细胞形态无明显变化,而高钙诱导培养的细胞出现形态变化,呈长梭形.Western blot蛋白条带可以看出,高钙诱导分化后的细胞中Sox9表达量减少,而低钙和正常培养的细胞中无明显变化;高钙诱导分化后的细胞中Lor表达量增多,在低钙和正常培养的细胞中表达量很少.四,ChIP结合ChIP-seq寻找Sox9结合的基因ChIP是目前研究体内蛋白与DNA相互作用的唯一手段.我们在前三章内容的基础上,对gHFSCs进行转录因子Sox9-ChIP得到蛋白-DNA复合物,利用ChIP-seq进行测序,获得与Sox9互作的基因信息.结果显示:对超声破碎效果良好的蛋白-DNA复合物进行纯化测序,ChIP-seq测序后得到了共10736个MACS-peaks和峰的位置信息.其中位于外显子区(exonic)的有2008个,内含子(intronic)区有2827个,基因间(intergenic)区有5433个,下游(downstream)区域有48个,上游(upstream)区域有61个,3,端非翻译区(UTR3)有292个,5,端非翻译区(UTR5)有28个,剪接(splicing)区有39个;利用de novo finding找到了36个未知的motif信息,通过转录因子motif数据和GO数据库比对得出96个已知的motif.Top motifs中排列第一的基序与Sox9 in vitro motif匹配.已知motif比对中包括明确的胚胎发育相关转录因子Nanog, Oct4,Sox2,Tcf;对测序得到的所有基因进行KEGG-pathway分析,跟据GO和KEGG中已有的信息共得到278条通路.其中p值小于0.05p0.05)的通路有FoxO信号通路,MAPK信号通路,cAMP信号通路,干细胞多能性调控通路和细胞骨架肌动蛋白调控通路等24条通路;p值小于0.01(p0.01)的通路有黏着斑(Focal adhesion),粘着连接(Adherens junction),Rap1信号通路,Wnt信号通路,Hippo信号通路等9条通路.

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关键词：

阿尔巴斯绒山羊 毛囊干细胞 多能性 Sox9 ChIP

学位级别：

博士

学位年度：

2016

DOI：

10.7666/d.Y3028164