二、培养方法

1. 细胞培养：Luc 标记的4T1 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，并置于37 ℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中。

2. 小鼠移植瘤模型制作：收集处于对数生长期的肿瘤细胞，用PBS 重悬稀释至1.0×107cells/ml，取0.1 ml 单细胞悬液接种于BALB/c 小鼠左侧第二对乳房垫下，共接种10 只，2 只空白对照接种等量的0.9% 氯化钠溶液。接种后第10 天取5 只荷瘤小鼠和1 只空白对照小鼠进行活体成像观察，剩余小鼠用于小动物PET/CT 成像观察。成瘤后每2天观测一次，测量肿瘤大小，连续观测28 d，绘制肿瘤皮下生长曲线。

3. 活体成像观察：观测前35 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，并按10 μl/g体质量的浓度向每支小鼠腹腔注射相应量的15 mg/ml 荧光素钾盐溶液，5 min 后进行活体成像观察肿瘤的生长情况，定量分析肿瘤荧光值。

4. 小动物PET/CT 成像：小鼠提前8 h 禁食，尾静脉注射290~320 μCi 18F-FDG 30 min 后， 35 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，挤压排空膀胱，取俯卧位固定于带保温装置的扫描板进行PET/CT 显像。采用感兴趣区技术（region-of-interest, ROI）测量颈部肌肉、棕色脂肪、肿瘤、肝脏、肾脏、心肌、哈氏腺的最大每克组织摄取率（the percentageinjected dose per gram, %ID/g=ROI 放射性活度/ 注射总放射性活度×100%）［4］

5. 病理形态学观察：BALB/c 小鼠接种肿瘤细胞后28 d，颈椎脱臼处死小鼠，解剖观察内脏有无转移，取肿瘤组织及转移灶放入10% 中性甲醛固定液固定，随后石蜡包埋并切片，切片厚度为3 μm，经苏木精—伊红染色后观察细胞的病理形态学情况。

结 果

一、生物发光活体成像观察

将Luc 标记的4T1 细胞在BLAB /c 小鼠乳房垫下接种后第10 天通过活体成像系统能检测到肿瘤细胞的生物发光信号，光子数为5.9×107，图像采集时间约5~10 min。在接种后第23 天肿瘤体积明显增大，为原来的2~3 倍，肿瘤中心荧光信号消失，出现坏死灶，荧光信号逐渐减弱，28 d 后处死小鼠并解剖（图1）。

图1 Luc 标记的4T1 乳腺癌小鼠模型生物发光活体成像观察 A 为肿瘤接种后第10 天；B 为肿瘤接种后第23 天；箭头示肿瘤位置

二、18F-FDG 小动物PET/CT 影像学观察

从PET/CT 图像可观察到肿瘤与膀胱两个部位是18F-FDG 摄取最高的部位，与空白对照的小鼠进行比对可清晰分辨肿瘤位置（图2、3），图像采集重建时间为20~30 min。肿瘤的18F-FDG 摄取高于其他器官、组织，（%ID/gmax）（38.40±12.84）。肿瘤/心脏的18F-FDG 摄取比率最高，为（3.89±1.87）。

图2 4T1 乳腺癌小鼠模型 18F-FDG PET/CT 显像 A、B、C 分别为荷瘤小鼠横截面、冠状面、矢状面；

D、E、F 分别为空白对照小鼠的横截面、冠状面、矢状面；箭头示肿瘤位置

图3 4T1 乳腺癌小鼠模型18F-FDG PET 显像 A、B、C 分别为荷瘤小鼠横截面、冠状面、矢状面；D、E、F 分别为空白对照小鼠的横截面、冠状面、矢状面；箭头示肿瘤位置

三、18F-FDG 小动物PET/CT 与生物发光活体成像的比较

对比两种成像技术的操作步骤、用时、用药以及图像呈现的效果等指标的结果如表1 所示。

表1 18F-FDG 小动物PET/CT 与生物发光活体成像的比较

四、肿瘤病理形态学观察

接种4T1 细胞6～8 d 接种部位出现肿瘤结节，成瘤率100%，瘤体增大，18 d 后瘤体生长加快，第26 天部分小鼠瘤体表面开始出现破溃( 图4 )。第28 天全部处死小鼠进行剖检，可见瘤体呈淡黄粉色，表面有少量血管，具有完整包膜并与周围组织粘连，切开瘤体发现中心坏死，部分小鼠的内脏伴有肺或脾转移。病理组织学观察显示，组织细胞呈巢状、团索状排列，局部可见坏死灶，癌细胞大小形态各异，细胞核大深染，可见核分裂现像，核仁清晰，符合乳腺癌组织细胞特征( 图5 ) 。

图4 Luc 标记的4T1 体内肿瘤生长曲线

图5 Luc 标记4T1 乳腺癌病理组织学观察（苏木精-伊红染色, × 200）

讨 论

当前乳腺癌的研究热点是其发病机制及药物治疗研究，而乳腺癌动物模型的制备及活体显像监测是肿瘤发病及转移机制和抗肿瘤药物体内研究的关键技术［5-6］。4T1 细胞来源于BALB/c 小鼠的乳腺癌细胞株，将其用于建立BALB/c 小鼠乳腺癌模型是目前临床药物筛选使用最多的一种乳腺癌模型，对于临床用药观察来说，1.0×107cells/ml的细胞浓度是最理想的模型制作方法［7-9］。乳房垫具有天然囊状结构及微血管丰富等特点，沈国栋等［10］将乳腺癌细胞接种于裸鼠肋部皮下、腋窝及乳房垫3 个部位进行比较，发现乳房垫接种的模型成瘤较早、生长较快。本实验将4T1 细胞原位移植于BALB/c 小鼠的乳房垫下使其成瘤培养出的模型，成瘤率高、肿瘤生长速度快，相对于常用于肿瘤模型建模的BALB/c 裸鼠或SCID 小鼠易于饲养，并且免疫功能正常，更适于临床治疗方面的研究。

光学成像技术主要有荧光与生物发光两种技术［11］。由于荧光成像需要激发光激发，会造成背景噪音较强、产生非特异性荧光，不利于观察，而生物发光成像是用荧光素酶基因标记细胞或DNA，通过酶和底物的特异作用而发光，具有特异性，可以直观、动态地观察动物模型中肿瘤的生长、侵袭和转移，因此本实验选择使用生物发光活体成像［12-15］。

小动物PET/CT 是当前进行动物模型研究最先进的工具，它整合了CT 的解剖学及PET 的功能学，从而多角度综合监控各种药物或治疗手段在病程中的生理和生化反应，提供药代动力学和生物分布等多方面的信息，18F-FDG 是目前临床PET/CT 上应用最多、最成熟的肿瘤代谢显像剂［15-16］。

小动物活体成像和小动物PET/CT 成像技术都具有灵敏度高、无创、实时、动态的观察动物活体的特点，大大减少实验动物的用量，与传统的实验方法相比更符合动物的伦理与福利原则［15］。本实验利用了活体荧光成像及小动物PET/CT 两种成像技术对4T1 乳腺癌BALB/c 小鼠模型进行了观察，乳腺癌模型活体荧光成像能够清楚观测到肿瘤生长部位，并且可根据荧光信号大致诊断出肿瘤的大小与状态，并且图像无任何背景噪音干扰，便于对肿瘤部位的观察。同时对此模型进行小动物PET/CT 影像学观察发现，小鼠胸壁靠腋下肿瘤凸起部位不规则椭圆形18F-FDG 高摄取区域，但其余部位如脑、膀胱、棕色脂肪等均有部分18F-FDG 摄取，对图像造成一定的背景噪音干扰。最后使用传统方法对模型进行了解剖学观察及肿瘤组织病理形态学分析，进一步验证了该模型的可行性。

实验过程中发现两种成像技术的敏感度及稳定性都比较高，由于成像原理不同，不可简单进行比较。不同点在于，小动物活体成像相比于小动物PET/CT 操作简单，图像采集时间短，价钱便宜，特异性好，无放射性，只要细胞存活就能检测到，多用于动态监测肿瘤细胞的大小与存活状态。李小颖等［17］使用小动物活体成像对荧光素酶标记的小鼠乳腺癌原位移植模型进行动态观察，成功观察到乳腺癌的生长及转移过程。但小动物活体成像的分辨率相比于小动物PET 较低，只有1~10 mm，只能浅表成像，并且不能对图像进行精准定位，生成的图像为二维图像，小动物PET 分辨率可达到小于1 mm，结合小动物CT 可达到精确定位的要求，生成三维立体图像，可定量分析反应细胞的生存状态和代谢能力［18-19］。虽然本实验中PET 显像剂用的是18F-FDG，特异性不够好，但随着各种新型PET 显像剂的开发研究，可针对不同疾病模型或不同的基因靶点设计新型探针达到不同的研究目的，从而提高PET 显像的特异性。何思敏等［20］构建了ZR-75-1 和MCF-7 两种ER 阳性原位乳腺癌模型，另建立MDA-MB-231 阴性模型为对照，对模型进行18F-FES PET/CT 显像，结果显示雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性肿瘤均明显摄取，阴性不摄取，认为18F-FES 可准确评价不同类型荷人乳腺癌模型的ER 表达水平，可用于进一步监测内分泌疗效。另外，PET 所用的显像剂大多有放射性，需要用回旋加速器生产，机器昂贵，仪器维护难，实验成本高，因此，需根据研究需求谨慎选择成像方法。

综上，本次实验成功构建了4T1 乳腺癌小鼠原位模型，并且成功运用生物发光活体成像和18F-FDG 小动物PET/CT 成像两种成像方法对模型进行了观察，对比两种成像方法的优缺点，为以后在疾病模型研究中实验动物的活体影像学监测手段的选择累积基础经验。

⭐️ ⭐️ ⭐️

目前常见的分子影像技术如X-射线成像、断层扫描成像（CT）、磁共振成像（MRI）和超声成像（US）被用于对疾病等的医疗诊断，但这些方法具有较差的空间分辨率及其无法实现动态实时监测等缺点。

传统荧光成像技术存在一个显著的缺点是探测深度相对较低，光子穿透能力受光子在生物组织的吸收以及散射影响，荧光成像的噪音与背景一般来源于生物组织的自体荧光以及光子散射。由于光折射率在微观尺度上存在的不均一性，生物组织体对光具有强散射性，然而这些散射一般随着光的波长增长呈指数性衰减。

近红外二区成像（1000-1700nm）与可见光成像（400-780nm）和近红外一区（780−1000nm）相比，因其在样品中的散射与吸收系数更小，因此具有更高的成像分辨率与穿透深度。近红外二区成像系统针对小动物成像分辨率一般可达30um，能对细小的血管直接成像；穿透深度大致为3cm，即便是小鼠最深的脏器发出的信号也能被检测到。

近红外二区光学成像技术以其高灵敏度、高时空分辨率、信噪比高、成像深度大、自发荧光低、生物损伤小等优点，为微小肿瘤/转移瘤及肿瘤相关血管的检测和研究提供了一种新的无创检测成像手段，在活体成像、疾病诊断、无创治疗、手术导航等领域应用前景广泛。

近红外小动物活体成像

相机部分：

1、成像模块采用TEC电制冷方式，工作温度达到-100℃；

2、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；

3、近红区与可见光区实时同步成像，图像同步精确融合；

4、近红区与可见光区实时同步录像，视频同步精确融合；

激光部分：

1、激发光源采用两种波长（808nm, 980 nm），功率可调；

2、两根液芯匀光光纤分布两侧无死角照射；

3、光纤末端配备准直器，可调激发光的均匀照射；

暗室及控制系统：

1、去除背景，实现成像的平场校正功能；

2、调节红外成像窗宽、窗位功能；

3、荧光寿命成像专用软件模块‘；

4、实现材料长时间的荧光寿命成像；

5、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差极小；

6、多通道气体麻醉，大视野满足多个小动物同时成像；

应用：

适合从事生物学、医学、材料等科研工作者，例如生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、激光光斑分析等领域。

⭐️ ⭐️ ⭐️ 应用案例⭐️⭐️ ⭐️

【案例1】NIR-I区与NIR-II区，成像范围、深度、清晰度对比：

【案例2】近红外二区成像在不通波长下成像比较

通过尾静脉注射PBS溶液中的NM-NPs雌性BALB/c小鼠。用1000LP、1250LP、1400LP滤光片进行160mW cm−2808 nm激光激发，当波长在1000~1400 nm之间变化时，血管的清晰度明显提高，1400LP滤光片NIR-II荧光成像的空间分辨率明显提高，清晰度显著提高。

【案例3】近红外二区成像用于药代释放测试

特定器官和组织中的药物浓度通常用破坏性方法测量，费时费力。针对小剂量毒性药物，可使用功能化的红外探针，与药物接触时发光峰会发生削弱与红移，以实现对药物的检测。将纳米探针放入可长时间存留于生物体内的条形生物膜中，并植入皮下、腹腔内等不同腔室，药物在腹膜内释放后，可检测到内侧纳米探针发光强度减弱与红移。

【案例4】近红外二区成像用于药代动力学监测

临床前药代动力学(PKs)的常用方法为在不同的时间点抽取血液，并通过不同的分析方法对血液水平进行定量。NIR-II可以通过测量麻醉小鼠眼睛和其他身体区域中标记化合物的荧光强度，无创地连续监测血液水平。通过非侵入性眼睛成像测量的血液水平与通过经典方法产生的结果之间有极好的相关性。全身成像显示预期区域(如肝脏、骨骼)有化合物积聚。所以眼睛和全身荧光成像的结合能够同时测量血液PKs和荧光标记化合物的生物分布。

【案例5】近红外二区成像在缺血性脑卒中应用

稀土纳米颗粒（RENPs）是一类稀土离子掺杂的荧光纳米材料，能够在近红外光激发下发射出位于第二近红外区的荧光。且其具有长荧光寿命、窄发射谱带、高光/化学稳定性、低毒性和可调谐荧光发射波长等优势，有望在生物分析和疾病诊断等领域发挥重要作用。利用染料敏化RENPs的复合材料，成功实现了非侵入性、高分辨率脑血管成像，清晰观察到脑血管网络结构及细小的毛细血管结构，并可实时监测生理过程中血液动力学及血管结构的变化。

缺血性脑卒中（Ischemic Stroke, IS）是导致长期残疾以及死亡的主要原因之一，该疾病的严重程度具有时间依赖性，及时评估IS对于该疾病的治疗以及预后起着至关重要的作用。利用比率型近红外二区纳米探针可有效富集在脑缺血病灶位点，可视化氧化应激水平用于及时评估IS。利用近红外二区成像的优势，该探针具有深层的脑组织穿透深度；基于目标物调控染料敏化RENPs发光的原理，该探针对高活性氧物种呈现优异的响应性能。综合以上功能，该探针通过可视化探针在病灶位点的富集程度以及氧化应激水平，在IS发生30min时即可对其进行监测，并评估其严重程度（传统磁共振成像则在IS发生24h才可观察到显著的信号变化）。

【案例6】近红外二区成像用于心肌梗死监测

利用近红外荧光成像的优越采集速度和近红外发射纳米粒子的有效选择性靶向，在急性梗塞事件后仅几分钟就获得了梗塞心脏的体内图像。

【案例7】近红外二区成像用于慢性肝脏疾病无创监测

准非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），由于缺乏用于监测炎症和肝纤维化进程的无创方法，肝活检仍是临床诊断NAFLD的金标。非酒精性脂肪性肝病的病理发展中氧化应激是关键驱动力之一，肝损伤和坏死性炎症由驱动纤维化的活性氧簇（ROS, Reactive oxidative species）介导，内源性脂褐素（lipofusion）是ROS的副产物，在808nm激光激发下，能够在近红外范围内被检测到，因此脂褐素的红外成像用于无创评估坏死性炎症活动和纤维化阶段，实现慢性肝病的无创监测。

【案例8】近红外二区成像用于阿尔兹海默症监测

近红外荧光(NIRF)成像已广泛用于临床前研究；然而，它的低组织穿透性对于神经退行性疾病的转化临床成像来说是一个令人生畏的问题。众所周知，视网膜是中枢神经系统(CNS)的延伸，被广泛认为是大脑的窗口。因此，视网膜可以被认为是研究神经退行性疾病的替代器官，并且眼睛由于其高透明性而代表理想的NIRF成像器官。利用CRANAD-X荧光探针标记淀粉样蛋白β(aβ)，并利用成像系统对眼部进行观察可以明显观察到患病前后及治疗前后眼部的荧光强度的差异，进而在未来的人类研究中具有显著的转化潜力，并可能成为未来快速、廉价、可获得和可靠筛查AD的潜在成像技术。

【案例9】近红外二区成像用于体内脂质积累情况监测

细胞中脂质异常积累，通常预示着动脉硬化、脂肪肝等疾病。采用单壁碳纳米管荧光探针，通过近红外发射无创测量细胞中的脂质积累。在注射24 h后，探针富集在肝脏部位，与脂质结合后会使发光峰蓝移，积累越多则蓝移现象越明显，由此实现对脂质的定量检测。该方法可广泛应用于简化药物开发过程，并推动脂质相关疾病的研究。

【案例10】近红外二区成像联合酶激活的纳米探针用于术中进行快速组织病理学分析

准确的分析病理组织是肿瘤手术成功的关键之一，一种可被基质金属蛋白酶(MMP)14激活的NIR-II纳米探针A&MMP@Ag2S-AF7P，可用于体内外神经母细胞瘤诊断和非破坏性的组织病理学分析。

（1）A&MMP@Ag2S-AF7P在正常组织中的荧光可以忽略不计；但是在神经母细胞瘤组织中，其荧光信号会由于过表达的MMP14抑制了Ag2S量子点和A1094之间的荧光共振能量转移(FRET)过程而被快速激活。

（2）与此同时,暴露的膜渗透多肽R9 (TAT-peptide)可以使得该纳米探针被癌细胞有效地内化，进而产生优越的T/N组织信号比值。该探针可以对病灶进行富集定位通过红外二区实时成像描绘出明确的肿瘤边缘，用于癌症手术或组织活检。

【案例11】近红外二区成像指导肿瘤摘除手术

NIR-II成像的高灵敏度可对肿瘤组织进行精准定位。利用靶向NIR-II荧光探针成像并引导进行小鼠头部肿瘤切除手术。实验分两组进行，在完全切除手术后(左二)，选区线扫结果显示病灶部位近红外信号明显减弱，与健康组织相似，在对比实验(右二，人为留下少部分肿瘤组织)中则观察到部分区域仍存在高强度信号，肿瘤组织的切除并不完全，表明NIR-II在肿瘤摘除手术中具有潜在的指导作用。

【案例12】近红外二区NIR-II协同肿瘤光热治疗

纳米粒子(NPs)辅助光热疗法(PTT)是一种有前途的癌症治疗方式，并且已经吸引了科学主流的注意。利用聚集诱导发射(AIE)纳米颗粒和肿瘤细胞来源的“外泌体帽”(TT3-oCB NP@EXOs)制备具有增强的第二近红外(NIR-II，900–1700nm)荧光特性和PTT功能。由于它们在808 nm照射下具有高且稳定的光热转换能力，因此TT3-oCB NP@EXOs可以用作仿生的NPs用于NIR-II荧光成像引导的肿瘤PTT，因此，随着其他靶向性差的AIE纳米粒子的验证，肿瘤细胞衍生的EXO/AIE纳米粒子杂化纳米囊泡可能为改善肿瘤诊断和PTT提供一种替代的人工靶向策略。

【案例13】近红外二区成像测试荧光寿命

⭐️ ⭐️ ⭐️ 案例结束⭐️⭐️ ⭐️

沈阳莫德医药自主研发近红外二区小动物活体荧光成像系统， 性能优异深受用户好评，欢迎您的咨询！

近红外小动物活体成像返回搜狐，查看更多