大鼠胎仔神经干细胞的培养

2024-07-11 12:46| 来源: 网络整理| 查看: 265

快速链接介绍制备培养基使用 CELLstart 底物包被培养容器大鼠 NSC 的扩增和传代神经球悬浮培养物订购信息相关产品信息神经细胞培养系统介绍

大鼠神经干细胞 (NSC) 是用于研究人脑发育、疾病过程和衰弱性中枢神经系统 (CNS) 疾病治疗策略的已确定模型。本方案描述了大鼠胎仔 NSC 在贴壁或神经球悬浮培养物中的体外扩增、传代和形态。

所需材料细胞Gibco 大鼠胎仔神经干细胞（货号 N7744-100）或使用交配后 14-18 天的大鼠脑组织制成的均匀细胞制备液培养基和试剂Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)（货号 14040）不含钙或镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)（货号 14190）StemPro NSC SFM（货号 A10509-01）StemPro Accutase 细胞解离试剂（货号 A11105-01）CELLstart CTS（货号 A10142-01）台盼蓝（货号 15250）（随 Countess 自动细胞计数仪提供）或 LIVE/DEAD 细胞活力检测试剂盒（货号 L34951）专用工具Countess 自动细胞计数仪（货号 C10227）或血细胞计数器返回顶部制备培养基用于扩增神经干细胞的培养基

StemPro NSC SFM 完全培养基包括 KnockOut D-MEM/F-12 以及 StemPro 神经补充剂、bFGF、EGF 和 GlutaMAX-I。在 2-8°C 下避光储存时，完全培养基可稳定放置 4 周。

制备 100 mL 完全培养基需要：

使用 0.1% BSA 溶液（溶于 KnockOut D-MEM/F-12）复溶 bFGF 与 EGF，使得浓度为 100 μg/mL。每 100 mL 完全培养基中各需要 20 μL。分装冷冻未使用的部分。在无菌条件下混合下列组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。组分最终浓度用量KnockOut D-MEM/F-121X97 mLGlutaMAX-I 补充剂2 mM1 mLbFGF（制成 100 μg/mL 储备液）20 ng/mL20 μLEGF（制成 100 μg/mL 储备液）20 ng/mL20 μLStemPro 神经补充剂2%2 mL

您可能在解冻 StemPro 神经补充剂的过程中发现白色沉淀；完全解冻或溶解后沉淀将消失

使用 CELLstart 底物包被培养容器

对于贴壁培养，按照如下所述制备含 CELLstart CTS 的平板。

在含钙和镁的 D-PBS 中以 1:100 稀释 CELLstart CTS（例如，将 50 μL CELLstart CTSinto 加入 5 mL D-PBS 中）。注：CELLstart CTS 不应冷冻、涡旋或由于可能形成凝胶而进行高强度搅拌。用 CELLstart CTS 的工作溶液包被培养容器的表面（T-75 培养瓶：14 mL，T-25 培养瓶：7 mL，60 mm 培养皿：3.5 mL，35 mm 培养皿：2 mL）。在 37°C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育培养容器 1 小时。从培养箱中取出容器，使用前在 4°C 下储存。临使用前去除所有 CELLstart CTS 溶液，并用完全 StemPro NSC SFM 填充容器。

注：您可以提前包被平板并将它们储存于 4°C 下，使用 Parafilm® 紧密包裹储存长达 2 周。请在临使用包被平板前去除 CELLstart CTS 溶液。请确保平板不会变干。

返回顶部大鼠 NSC 的扩增和传代贴壁培养重悬大鼠胎仔 NSC，如下所示：对于新制备的大鼠胎仔 NSC，用 D-PBS 冲洗后将其重悬于温热的完全 StemPro NSC SFM 中，使得密度为 1 × 107 个活细胞/mL。对于解冻的大鼠胎仔 NSC，在测定活细胞计数后将其重悬于温热的完全 StemPro® NSC SFM 中，使得细胞密度为 1 × 107 个活细胞/mL。将大鼠胎仔 NSC 铺到 CELLstart CTS 包被的培养容器中，铺板密度为 5 × 104 个细胞/cm2。有关常见培养容器的建议接种密度，请参见下表。

容器尺寸生长面积培养基体积细胞数量96 孔板0.32 cm2/孔0.1 mL1.6 × 10424 孔板1.9 cm2/孔0.5 mL1.0 × 10512 孔板3.8 cm2/孔1 mL1.9 × 10535 mm 培养皿8 cm2/孔2 mL4.0 × 1056 孔板9.6 cm2/孔2 mL4.8 × 10560 mm 培养皿19.5 cm25 mL9.8 × 105T-25 培养瓶25 cm25 mL1.3 × 106100 mm 培养皿55 cm210 mL2.8 × 106T-75 培养瓶75 cm215 mL3.8 × 106向各培养容器中加入适当体积的细胞，并在 37°C、5% CO 2 和 90% 湿度条件下孵育。每 2-3 天使用新鲜的完全 StemPro NSC SFM 对大鼠胎仔 NSC 培养物进行重新换液。大鼠胎仔 NSC 的形态应表现为密度均匀的短星状突起（参见下图 1）。

图 1.使用 StemPro NSC SFM 进行贴壁培养的第 3 代大鼠胎仔 NSC。

当细胞汇合度达到 75%-90% 时（接种后 3-4 天），大鼠胎仔 NSC 培养物即可传代。用不含钙和镁的 D-PBS 冲洗培养容器一次，然后去除培养基。加入预热的 StemPro Accutase，使细胞从培养物表面分离（约 30 秒内）。分离后，轻轻上下吹吸细胞，将细胞团块分解成均匀的细胞悬浮液，并向培养容器中加入四体积的完全 StemPro NSC SFM。通过在培养物表面上吹吸数次使细胞分散，以生成均匀的细胞溶液。将细胞转移至无菌离心管中并在室温下以 300 × g 离心 4 分钟。吸出并弃去培养基。将细胞沉淀重悬于最小体积的预热完全 StemPro NSC SFM 中，并取出样本进行计数。利用台盼蓝染色剂或 LIVE/DEAD 细胞活力检测试剂盒测定细胞总数和活力百分比。向试管中加入足够的完全 StemPro NSC SFM，使得细胞溶液最终浓度为 1 × 106 个活细胞/mL。在 37°C、5% CO2 和 90% 湿度条件下孵育。大鼠胎仔 NSC 培养不应超过 3 代。

重要提示：如果您使用完全 StemPro NSC SFM 以外的生长培养基对大鼠胎仔 NSC 进行重新换液，请确保培养基添加有 10 ng/mL bFGF，以维持大鼠胎仔 NSC 的未分化状态。

返回顶部神经球悬浮培养物重悬大鼠胎仔 NSC，如下所示：对于新制备的大鼠胎仔 NSC，用 D-PBS 冲洗后将其重悬于温热的完全 StemPro NSC SFM 中，使得细胞密度为 1 × 107 个活细胞/mL。对于解冻的大鼠胎仔 NSC，在测定活细胞计数后将其重悬于温热的完全 StemPro NSC SFM 中，使得细胞密度为 1 × 107 个活细胞/mL。将大鼠胎仔 NSC 铺到未包被或低吸附的培养容器中，铺板密度为 2 × 105 个活细胞/cm2。有关推荐的接种密度，请参见下表。

容器尺寸生长面积培养基体积细胞数量96 孔板0.32 cm2/孔0.1 mL6.4 × 10424 孔板1.9 cm2/孔0.5 mL3.8 × 10512 孔板3.8 cm2/孔1 mL7.6 × 10535 mm 培养皿8 cm2/孔2 mL1.6 × 1066 孔板9.6 cm2/孔2 mL1.9 × 10660 mm 培养皿19.5 cm25 mL3.9 × 106T-25 培养瓶25 cm25 mL5.0 × 106100 mm 培养皿55 cm210 mL1.1 × 107向各培养容器中加入适当体积的细胞，并在 37°C、5% CO 2 和 90% 湿度条件下孵育。每 2-3 天使用新鲜的完全 StemPro NSC SFM 对大鼠胎仔 NSC 的神经球悬浮液进行重新换液，而不取出任何发育中的神经球。神经球的形态应表现为球形和透明的多细胞复合物（参见图 2）。

图 2.使用 StemPro NSC SFM 进行神经球培养的第 3 代大鼠胎仔 NSC。

当神经球直径达到 3.5 mm 或更大时，大鼠胎仔 NSC 即可传代。将神经球悬浮液转移至无菌离心管中，让神经球利用重力沉降或以 200 × g 离心 2 分钟。小心地吸出上清液，将神经球保留在最小体积的培养基中。用不含钙和镁的 D-PBS 冲洗神经球一次，保留最小体积的 D-PBS。向神经球中加入 1 mL 预热的 StemPro® Accutase，并在室温下孵育 10 分钟。孵育后，轻轻上下吹吸细胞，得到单细胞悬浮液，并向试管中加入 4 mL 完全 StemPro NSC SFM。在室温下以 300 × g 离心 4 分钟，小心吸出上清液，将细胞重悬于最小体积的预热完全 StemPro NSC SFM 中，并取出样本，在血细胞计数器或 Countess 自动细胞计数仪上计数。测定细胞总数和活力百分比。向试管中加入足够的完全 StemPro NSC SFM，使得细胞溶液最终浓度为 1 × 107 个活细胞/mL。在 37°C、5% CO2 和 90% 湿度条件下孵育。神经球悬浮培养不应超过 3 代。

LT149 2011 年 3 月 17 日

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