半导体纳米颗粒具有典型的光催化特性，当入射光子能量高于禁带宽度时，光电子会从能量较低的价带跃迁到能量较高的导带，在原价带位置留下空穴，形成光电子-空穴对，进而参与氧化还原反应[1-2]。基于此，半导体纳米材料在光解水产氧/氢、污染物降解、光敏材料制备和电子传输器件等方向具有广阔的应用前景。

此前研究中，国内外学者广泛关注半导体纳米材料的抑菌能力[3]，其机理主要有两方面：一是半导体材料释放重金属离子对细胞具有毒性作用[4-5]；二是半导体材料经光激发后，其光生电子和空穴与微生物细胞膜或胞内物质反应，使功能分子失活，或基于氧化还原反应，与环境内氧分子/水分子结合，产生超氧自由基，对菌体细胞结构造成损伤，导致菌体死亡[6]。尽管半导体纳米颗粒对微生物生长具有明显毒性，但近年研究发现，半导体光生电子可能对细菌生长具有促进作用，参与胞内电子传递和能量流动。2012年，Lu等[7]首次提出天然半导体矿物产生的光生电子可促进化能自养菌氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans) 和化能异养菌粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis) 的生长。之后，Sakimoto等[8]利用热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica) 与硫化镉纳米粒子(cadmium sulfide nanoparticles, CdS NPs) 杂化耦合构建“半导体-微生物”光合杂化系统，经光激发后，光生电子可与氢化酶作用提高胞内还原力，并通过Wood-Ljungdahl通路固定CO2。此外，微生物也可以自发地在胞内外合成半导体纳米颗粒，经光激发后，光生电子直接参与细菌电子传递，增强胞内代谢能力[9-10]，如促进细菌产氢[11-13]、固定CO2[14-16]和产聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)[17]等作用，提高胞内还原酶活性[18]。目前的研究多是利用半导体光生电子促进菌株产生更多有价值的代谢产物，而对利用光生电子对菌株生长的影响并没有较多的报道。

针对上述问题，本研究选取大肠杆菌(Escherichia coli) ATCC 15597作为研究对象，旨在探究半导体CdS NPs在可见光激发下对细菌生长的影响。本研究通过外源添加CdS NPs与细菌共培养，对CdS NPs促进细菌生长的条件进行探索，确定其最佳反应条件；研究在该条件下，细菌胞内参与氧化应激反应关键酶的活性变化；同时观察此过程中细胞膜主要成分和参与代谢的主要物质含量变化，判断细菌生存状态，分析细菌接受光生电子后的生理情况，为深入探究微生物利用光生电子的行为模式提供科学依据和研究基础。

3, 5-二硝基水杨酸(3, 5-dinitrosalicylic acid, DNS) 购自上海展云化工有限公司；维生素C (vitamin C, Vc) 购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、(NaPO3)6、Na2HPO4·12H2O、NaCl、KH2PO4、NH4Cl、CaCl2、MgSO4·7H2O、CdCl2、Na2S及其他化学试剂皆为分析纯。

试验菌株选用购自The Global Bioresource Center的E. coli ATCC 15597，采用改良的M9培养基(1/6碳源) 进行培养，对细菌菌落计数时采用LB固体培养基。

改良的M9培养基：配置1 mol/L的MgSO4·7H2O溶液10 mL，高温高压灭菌(121 ℃, 15 min) 备用；配置1 mol/L的CaCl2溶液10 mL，高温高压灭菌(121 ℃，15 min) 备用；配置5×M9溶液：Na2HPO4·12H2O 19.6 g，KH2PO4 3.0 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1.0 g，使用双蒸水溶解，高温高压灭菌(121 ℃, 15 min) 备用；配置3.33%葡萄糖溶液20 mL，0.22 μm滤器过滤除菌备用；在无菌工作台将前4步溶液混合，补充无菌水至1 L，备用。

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂糖15−20 g/L。pH调至7.00±0.02。

通过改良的超声法合成方法合成CdS[19]。首先，分别配制0.1 mol/L的CdCl2、Na2S和(NaPO3)6溶液。按体积比6︰3︰20混合，其中Na2S以滴定的方式缓慢加入混合溶液，可见溶液颜色由无色变为明黄又变橙黄。随后进行超声处理，用定性滤纸过滤后收集滤液，置于真空干燥箱中烘干，于暗处保存。

采用日本电子株式会社的JEM-2100透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM) 观察CdS NPs的外貌形态，同时通过X-射线能量色散谱方法(dnergy dispersive X-ray spectroscopy, EDS) 分析表面元素组成。利用荷兰帕纳科的X’Pert3 PowderX射线衍射仪对CdS纳米颗粒进行X射线衍射(X-ray diffraction, XRD) 分析，测试扫描范围10°− 80°，扫描速度10°/min。通过北京普析通用仪器有限责任公司的TU-1901紫外-可见吸收分光光度仪(UV-vis absorption spectrophotometer) 进行紫外-可见漫反射光谱(UV-Vis diffuse reflectance spectroscopy, UV-Vis DRS) 分析，将结果通过公式(αhv)2=A(hv-Eg) 推导出Tauc plot[20]，计算得到纳米粒子的带隙宽度。进行Mott-Schottky和I-t等电化学分析(电化学工作站, 上海辰华, CHI-760E)，分别获得平带电位和纳米粒子对光照的响应情况；将CdS附着在玻碳电极上作为工作电极，Pt作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，使用0.2 mol/L的Na2SO4作为电解液进行检测。

接种菌株于250 mL且加入100 mL的改良的M9培养基的锥形瓶中，于37 ℃、200 r/min的数显振荡培养箱培养12 h (OD600=1.0)，所得菌液用于后续实验。

取5 mL上述已经培养好的菌液，接种至50 mL且装有25 mL改良M9培养基的锥形瓶中。本文在大肠杆菌接种时添加外源CdS NPs，置于不同的条件下进行静置培养，探究在光照条件下对细菌生长的影响。实验中使用全波长的氙灯作为光源，光强为1 500 lx；实验过程中同时探究了不同变量，添加不同浓度的CdS NPs、使用不同种类和不同浓度的牺牲剂对细菌生长的影响。细菌生长状况通过测定吸光值(OD600) 和CFU进行分析。

培养过程中，对照组和实验组分别设计为：仅黑暗培养(dark)、仅光照培养(light)、黑暗添加CdS NPs培养(dark-CdS) 和光照添加CdS NPs培养(light-CdS)。

样品前处理：E. coli在最适生长条件下培养处理24 h后，将样品离心所获沉淀用于后续实验。

分别采用格锐思生物科技有限公司的过氧化氢酶试剂盒(G0105F)、过氧化物酶试剂盒(G0107F) 和超氧化物歧化酶试剂盒(G0101F) 对细菌生长过程中的过氧化氢酶(catalase, CAT)、过氧化物酶(peroxidase, POD) 和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 进行检测分析。所有实验步骤均按试剂盒说明书进行。

使用格锐思生物科技有限公司的丙二醛试剂盒(G0109F) 对细菌生长过程中的丙二醛(malondialdehyde, MDA) 的浓度进行检测。所有实验步骤均按试剂盒说明书进行。

样品处理方法同上。使用格锐思生物科技有限公司的丙酮酸试剂盒(G0807F) 对细菌生长过程中的丙酮酸(pyruvic acid, PA) 的浓度进行检测。所有实验步骤均按试剂盒说明书进行。

将E. coli在最适条件下培养，分别取24 h、48 h和72 h时的细菌混合液置于高速冷冻离心机中离心，4 ℃、8 000 r/min离心10 min。弃上清，将获得的菌体置于液氮中保存。根据TaKaRa公司试剂盒进行RNA的提取，再将RNA反转录为cDNA，使用获得的cDNA在LightCycler 480型仪器上进行实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, RT-qPCR) 反应，测定功能基因的相对表达量。

RT-qPCR反应设置3个重复，目的基因和引物如表 1所示。PCR反应体系：cDNA (45 ng/μL) 2 μL，上下游引物(0.1 nmol/μL) 各0.8 μL，ddH2O 6 μL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL。PCR反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃延伸1 min。采用2–ΔΔCt法进行相对定量计算，–ΔΔCt可根据以下公式计算：

通过TEM观察(图 1A)，可见CdS NPs在30−80 nm之间，而且比较分散。EDS结果(图 1A插图) 显示，其主要成分是S元素和Cd元素，比例接近1︰1。使用XRD对CdS的晶体结构进行分析(图 1B)，发现其在26.54°、43.97°和52.16°的衍射峰分别对应(111)、(220) 和(311) 晶面，与CdS标准卡片(JCPDS 10-0454) 相一致，说明所合成的CdS属于立方晶型。

半导体的光电反应活性是评价其性能的重要指标[21]。在本研究中，利用UV-Vis DRS检测CdS NPs的光吸收情况(图 1C插图)，可知其吸收带边在530 nm左右。将光谱数据经计算可得到Tauc Plot (图 1C)，图中直线段与X轴交点为禁带宽度，即2.5 eV。结合Mott- Schottky分析(图 1D)[22]，可知其平带电势为−0.75 V。且图中曲线斜率为正，说明CdS NPs属于n型半导体[23]。根据n型半导体导带电位比平带电势正0.1 V的原理[24]，可推算其导带电势为−0.65 V，价带电势为1.85 V。通过瞬时光电流响应测试(图 1E) 观察到CdS NPs对光具有良好的响应，在光照射下可产生明显光电流。因此，合成的CdS NPs分散性良好，具有合适的带隙宽度并且对光照有迅速的响应，适合作为本项研究的实验材料。

将不同浓度的CdS NPs加入到大肠杆菌培养基中，根据OD600和CFU判断菌株生长状况。由OD600和CFU值观测到，CdS NPs的加入对大肠杆菌生长具有促进作用，且随CdS NPs浓度升高而愈加明显。根据图 2A、2B和表 2数据可知，大肠杆菌生长数量随CdS NPs浓度增加，呈现先增大再减弱的趋势。当CdS NPs加入浓度为60 mg/L时，大肠杆菌的生长数量最多，是正常培养的1.34倍，差异性显著。当CdS NPs浓度高于60 mg/L时，可能由于Cd2+离子和超氧阴离子浓度增加，重金属毒性和氧化毒性增强，导致细菌数量减少。

CdS NPs作为典型半导体，在光照条件下会产生光电子-空穴对，但其极易复合，丧失氧化还原能力。若在半导体光反应体系中加入牺牲剂，可与光空穴或其引发的超氧阴离子发生反应，消耗光空穴，进而提高光电子-空穴的分离效率，增加光生电子还原能力。本研究为增强CdS NPs与大肠杆菌之间的电子传递能力，实验不同浓度Vc作为牺牲剂的应用情况。实验发现，添加Vc可改善CdS NPs促进大肠杆菌生长的效果(图 2C、2D和表 3)，而且随着添加浓度的提高，生长速率也升高；当浓度是10 mmol/L时，具有最高的促进作用，同时与只加入Vc没有添加CdS NPs的对照组有最大差异，差异性显著。而使用甲醇作为牺牲剂时，无论浓度高低，对大肠杆菌均没有促进效果(图 2E、2F和表 4)。

从上述结果可以看出，使用OD600可以代表菌落的生长状态。在最佳培养条件下，即添加CdS NPs浓度为60 mg/L、牺牲剂Vc浓度为10 mmol/L培养大肠杆菌时，可得其生长曲线(图 2G和2H)。由此可知，当菌株生长状态进入稳定期时，Light-CdS培养大肠杆菌组的OD600值分别较Dark、Light和Dark-CdS培养组高32.4%、15.3%和11.8%，由此可知，光照条件下添加CdS NPs对E. coli的生长具有显著的促进作用。

CdS NPs作为一种典型的半导体纳米粒子，可以光激发产生光电子-空穴对。其中光空穴具有较高的氧化能力，同时会在液体环境中产生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，对E. coli造成损害[25-26]。而微生物本身具有应对ROS的防御机制，如产生CAT、POD和SOD等与之反应，降低细菌胞内氧化压力并造成酶活的降低[27]。为探究大肠杆菌响应CdS NPs光氧化压力的作用，本实验在不同条件下培养大肠杆菌，测定培养24 h后菌株胞内CAT、POD和SOD的酶活(图 3)。在相同添加CdS NPs培养条件下，黑暗处理时CAT具有更高的酶活，而光照处理相反，各个处理条件的酶活是：Dark-CdS > Dark > Light-CdS > Light，由于酶活越低意味着该条件氧化压力越高，因此Light-CdS有较高的氧化压力，且差异显著。而CdS NPs的加入和光暗条件的变化，并未对细菌SOD的合成带来显著影响；虽然不同处理条件下POD有很大差异性，但是其总体的酶活很低不会对菌生长造成显著影响，可以忽略不计。

MDA是机体内多不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化物，其浓度越高，说明由多不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化物越多，即细菌细胞膜的通透性越高。因此，检测MDA浓度变化可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞膜的通透性。

如表 5所示，4种处理条件的MDA浓度关系是：Light-CdS > Dark-CdS > Dark > Light，光照下加入CdS NPs产生的MDA浓度明显更高。其中Light-CdS处理条件的MDA浓度比Dark处理的MDA浓度高了32.3%，表明在该条件下细菌细胞膜具有更高的通透性。这可能是因CdS NPs光生电子跨膜运输所引起，光电子穿过细胞膜进入E. coli细胞并参与到电子传递链。根据CAT酶活和MDA浓度的结果可以看出，Light-CdS组中E. coli有更高的氧化压力，导致更低的CAT酶活和更高浓度的MDA；虽然更高的氧化压力会抑制细胞的生长，但是细胞膜通透性提高，有更高的电子传递效率，因此光照下添加外源CdS NPs不仅抵消了CdS NPs对细菌生长的毒性，而且实现了促进生长的作用。

PA是细菌中心碳代谢的重要中间产物，既是糖酵解途径的终产物，又是三羧酸循环的重要底物，在营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。因此，PA的积累量也反映了细菌的生长代谢情况。

将大肠杆菌接种到改良的M9培养基培养24 h后，检测PA的浓度。如表 6所示，4种处理条件的PA浓度关系是：Light-CdS > Light > Dark > Dark-CdS，光照条件下加入CdS NPs会使细菌具有更高的PA浓度。其中Light-CdS处理条件的PA浓度比Dark处理的PA浓度高了34.6%，即糖酵解途径和三羧酸循环途径中碳代谢水平有所提高[12]，需要更高浓度的PA参与到反应中，是E. coli生长更加迅速的需求。但是考虑到PA的积累也可能是由于后续的代谢途径受阻，因此对后续代谢的基因相对表达量进行测定。

FtsZ蛋白是调控细菌分裂的必需功能蛋白，由ftsZ基因编码。在细菌分裂时，Z环收缩完成细胞分裂，FtsZ蛋白是组成Z环的数十种蛋白之一[28]。因此，ftsZ基因的相对表达情况通常用于评价细菌的生长分裂状态。异柠檬酸脱氢酶和柠檬酸合酶是三羧酸循环的关键酶，分别由icdA和gltA基因编码。本研究检测了24 h时icdA和gltA的相对表达量，以此评价E. coli三羧酸循环的状态。

从图 4A可以看出，在光照条件下添加CdS NPs后，ftsZ相对表达量均有所提高。将Light-CdS组的相对表达量分别与Dark、Light和Dark-CdS相比较发现，在24 h时，Light-CdS组的ftsZ基因相对表达量分别较之上调了228%、270%和76%；48 h时，分别较之上调了91%、201%和91%；72 h时，除了Light-CdS/Light外，相对表达量分别上调了65%和51%。总体上，fstZ的相对表达量逐渐减低，原因可能是随着时间的推移，有限的代谢底物使E. coli生长趋于稳定。不难发现，在培养过程中，Light-CdS组基本保持较无光照对照组的基因表达量高50%以上的优势。这说明，光照条件下添加CdS NPs可以有效地提高E. coli的分裂，即提高E. coli的生长，这与细菌OD600的结果一致。

根据图 4B结果，在光照条件下添加CdS NPs后，icdA和gltA相对表达量均有所提高。Light-CdS组icdA基因相对表达量比Dark、Light和Dark-CdS上调86%、25%和82%，而Light-CdS组gltA基因相对表达量比Dark、Light和Dark-CdS上调103%、38%和75%。因此，可以得出结论，Light-CdS组三羧酸循环相对其他组有所提高，这个结果与测定PA浓度的结果一致。E. coli有更高的PA积累量和三羧酸循环，可以推断出加入CdS后施加光照会调高E. coli的代谢水平。

本研究探讨了CdS NPs对E. coli生长的影响。研究发现光照条件下，加入60 mg/L的CdS NPs，并以10 mmol/L的Vc作为牺牲剂，大肠杆菌的OD600提高了32.4%。结果显示，体系中PA和MDA的浓度分别提高了34.6%和32.3%。分裂蛋白编码基因ftsZ相对表达量在24 h、48 h和72 h分别上调了228%、91%和65%。三羧酸循环关键基因icdA和gltA基因相对表达量上调了86%和103%，说明三羧酸循环水平提高，结合前期实验中PA的更高积累量，证明糖代谢水平有所提高。同时ftsZ基因相对表达量一直处于较高水平，因此E. coli一直保持较高的分裂状态。虽然添加CdS NPs会提高E. coli的氧化压力，但是光照培养条件下添加CdS NPs对细菌生长的促进作用大于毒性影响。综上所述，在光照条件下，半导体CdS NPs产生的光电子可明显促进大肠杆菌的生长。