β-1,3-葡聚糖是一类广泛存在于自然界中的高分子多糖，其主链由葡萄糖单元通过β-1,3-糖苷键连接。一些天然β-1,3-葡聚糖同时还含有不同比例和大小的通过β-1,6-糖苷键连接的支链。天然β-1,3-葡聚糖广泛分布于真菌、细菌和植物中。β-1,3-糖苷键的连接方式及分子间的氢键相互作用，长链β-1,3-葡聚糖在天然状态下通常会呈现不同的螺旋型三级结构，这些特殊的三级结构赋予β-1,3-葡聚糖多样的生物功能，包括调节免疫力、促进肠道益生菌增殖、调节血糖平衡及降低胆固醇等。

β-1,3-葡聚糖酶在食品和医药领域有着广泛的应用价值，上海大学生命科学学院的魏夏森、高海燕*、秦臻*等总结典型β-1,3葡聚糖酶的结构、功能及应用领域的研究进展，旨在为其后续催化机理研究及其在食品、医药等领域的应用提供参考。

1β-1,3-葡聚糖酶的分类及其催化机制

β-1,3-葡聚糖酶根据其催化方式可以分为内切型和外切型两种类型。内切β-1,3-葡聚糖酶（EC3.2.1.39）又被称为昆布多糖酶，是一种专一性水解β-1,3-葡聚糖糖链中β-1,3-糖苷键的酶类，在自然界β-1,3-葡聚糖的分解、重构中发挥关键生物学功能，在β-1,3-葡聚糖酶系中具有重要意义。内切β-1,3-葡聚糖酶从糖链内侧水解β-1,3-葡聚糖，产生一系列不同聚合度的寡糖。外切β-1,3-葡聚糖酶（EC3.2.1.58）则从糖链的非还原端逐一水解β-1,3-葡聚糖底物，水解产物一般为葡萄糖或单一寡糖，在β-1,3-葡聚糖的降解过程中起辅助作用。

基于其序列进化关系，根据CAZy数据库（http://www.cazy.org/）的分类，已发现的β-1,3-葡聚糖酶可归属于12 个糖苷水解酶（GH）家族。其中，内切β-1,3-葡聚糖酶可以归属于9 个GH家族（图1）；已发现的外切β-1,3-葡聚糖酶可以归属于6 个GH家族：GH3、GH5、GH17、GH55、GH128和GH132。

β-1,3-葡聚糖酶具有两种水解机制，分别是保留型机制和反转型机制。保留型水解机制的催化过程分为两个步骤，首先，活性中心的谷氨酸残基作为广义酸（质子供体），给糖苷键氧提供一个质子来切去离去基团，使β-1,3-糖苷键断裂，并形成酶-糖基中间体。随后，活性中心的谷氨酸残基作为广义碱，协助水分子攻击酶-糖基中间体的异头碳位置。最终，底物的β-1,3-糖苷键被水解，形成最终的水解产物。反转型机制的β-1,3-葡萄聚糖酶涉及两个保守的催化残基，分别为广义酸及一个广义碱。在反应历程中，广义酸首先提供一个质子给底物的异头碳，同时广义碱从水分子中去除一个质子，增加了其亲核性，促进其攻击异头物的中心，从而使糖键断裂，生成水解产物（图2）。

2β-1,3-葡聚糖酶的来源及制备

β-1,3-葡聚糖酶主要来源于真菌、细菌、植物、昆虫以及软体动物中。表1统计了目前已报道的具有应用潜力的不同来源的典型β-1,3-葡聚糖酶。目前已报道的产β-1,3-葡聚糖酶的细菌主要有热球菌（Pyrococcus furiosus）、多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）、芽孢杆菌（Bacillus lehensisG1）、链霉菌（Streptomycessp.）等。真菌和植物也是β-1,3-葡聚糖酶的重要来源，主要包括烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、棘孢木霉（Trichoderma asperellum）、白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）、大麦、葡萄等。天然来源的β-1,3-葡聚糖酶资源丰度、性质稳定，显示出特定的催化活性，表现出独特的应用潜力，如土壤芽孢杆菌（Paenibacillus terrae）产生的β-1,3-葡聚糖酶可有效抑制植物病原真菌的生长，在植物保护等方面发挥重要的作用；来源于魁蚶（Arca inflata）的β-1,3-葡聚糖酶活力较高，对肿瘤坏死因子等表现出免疫增强效果。来源于哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的β-1,3-葡聚糖酶是生产β-1,3-寡糖苷的理想候选酶，可用于寡糖的工业制备。

目前，β-1,3-葡聚糖酶的重组表达制备宿主主要包括大肠杆菌、毕赤酵母、芽孢杆菌等。大肠杆菌表达系统相对于酵母表达系统来说技术更成熟、操作相对简单，被广泛应用于新型β-1,3-葡聚糖酶的发掘和制备。来源于稻瘟病菌的β-1,3-葡聚糖酶MoGluB可通过大肠杆菌系统高效表达，并表现出抗真菌的作用。虽然大肠杆菌原核表达具有生长迅速、成本低廉等优点，但是，由于原核表达系统无法识别真核转录和翻译元件，并且不具有翻译后加工修饰功能，会导致部分真核基因无法被有效表达。因此，近年来研究者也常用真核表达系统表达β-1,3-葡聚糖酶，例如毕赤酵母、芽孢杆菌等表达体系。毕赤酵母在诱导表达过程中，自身所分泌的蛋白量较少，因此目的蛋白的表达量相对较高，但由于部分β-1,3-葡聚糖酶对于酵母细胞壁具有水解作用，因此，其适用性需要进一步实验验证。异源重组表达技术目前已成为β-1,3-葡聚糖酶酶学研究及制备应用的重要方法。同时，结合结构生物学、分子生物学、定向进化等研究方法对异源重组表达得到的β-1,3-葡聚糖酶进行分子改造，可进一步提高酶的催化性能及应用价值。

3β-1,3-葡聚糖酶的结构与催化机制

3.1 内切型β-1,3-葡聚糖酶

内切型β-1,3-葡聚糖酶又称昆布多糖酶，可以特异性地从β-1,3-葡聚糖链内部随机水解切断β-1,3-糖苷键，产生长短不一的低聚糖。已有报道的内切型β-1,3-葡聚糖酶主要分布于GH16、GH17、GH64与GH81 4 个GH家族。到目前为止，GH16、GH17、GH64、GH81、GH128与GH158 6 个GH家族的内切型β-1,3-葡聚糖酶结构和催化机制已得到解析，而GH55、GH152、GH157中鲜有关于内切型β-1,3-葡聚糖酶结构的报道，其详细的催化机制还有待进一步明确。

1） GH16家族内切型β-1,3-葡聚糖酶

目前已报道的GH16家族β-1,3-葡聚糖酶全部为内切型，广泛分布于细菌、真菌及古生菌中，以细菌来源为主。GH16家族β-1,3-葡聚糖酶三级结构富含β-折叠，这些链弯曲折叠成两个面对面反向平行的片层结构，构成一个供长链底物结合的狭长催化凹槽。GH16家族β-1,3-葡聚糖酶三维结构整体呈一种果冻卷结构，又称三明治夹心结构（图3）。GH16家族的β-1,3-葡聚糖酶遵循典型的保留水解机制，在反应历程中会形成不稳定的酶-糖基中间体。GH16家族β-1,3-葡聚糖酶的底物特异性与催化凹槽构造直接相关，对不同的底物具有不同的水解能力。这是由于ZgLamA催化中心呈现出弯曲凹槽的构象，有利于结合螺旋型的β-1,3-葡聚糖而不是直线型的β-1,3-1,4-葡聚糖（图3B）。

2） GH17家族内切型β-1,3-葡聚糖酶

GH17家族β-1,3-葡聚糖酶包括内切型和外切型两种，且大部分是内切型，主要来源于植物。目前，得到结构解析的GH17家族β-1,3-葡聚糖酶均为内切型。GH17家族蛋白呈典型的（β/α）8 TIM（triose-phosphate isomerase）桶状结构（图4），由8 个α-螺旋和8 个β-折叠环绕而成，在整个酶的表面形成了一个能够容纳长链底物的狭长催化凹槽并贯穿而过。桶状结构核心区域的β链是高度保守的，主要差异都发生在蛋白外围的环结构和螺旋结构处。GH17家族内切型β-1,3-葡聚糖酶与GH16家族类似，遵循典型的保留型水解反应机制，反应历程中会形成不稳定的酶-糖基中间体。

Wojtkowiak等获得了马铃薯内切型β-1,3-葡聚糖酶（GLUB20-2）突变体E259A与昆布多糖共结晶的晶体结构（图4B），这是研究者得到的首个GH17家族糖苷水解酶与寡糖分子的复合晶体结构。即使将其活性位点突变，GLUB20-2E259A仍具有残存活性，质谱分析揭示该突变体用两种方式切割了昆布六糖，分别产生两个昆布三糖分子或者一个昆布四糖分子和一个昆布二糖分子。GLUB20-2的催化凹槽形成了两端开口中间弯曲的峡谷型几何构象，该构象排除了直线型底物如β-1,4-葡聚糖与结合位点结合的可能，这表明活性位点裂隙的几何形状决定了酶的底物特异性。

3） GH64家族内切型β-1,3-葡聚糖酶

目前，已报道的GH64家族蛋白全部为内切型β-1,3-葡聚糖酶，主要来源于细菌。GH64家族内切型β-1,3-葡聚糖酶又称为昆布五糖型β-1,3-葡聚糖酶，特点是催化水解β-1,3-葡聚糖的水解产物以昆布五糖为主。GH64家族内切型β-1,3-葡聚糖酶遵循典型的反转型催化机制，催化中心附近的天冬氨酸残基作为广义碱，而谷氨酸残基作为广义酸参与水解反应。LPHase由两个结构域组成，C末端是由α-螺旋和β-折叠构成的α/β结构域，N末端是由两组反向平行的β-折叠组成的结构域，两个结构域之间形成了U型催化凹槽（图5）。Qin Zhen等报道了一种来源于巴伦氏类芽孢杆菌（Paenibacillus barengoltzii）的GH64家族β-1,3-葡聚糖酶（PbBgl64A）与昆布六糖的结合形式，即两条寡糖链形成一个螺旋，同时与PbBgl64A的催化凹槽结合（图5B、C）。这两条链的构象与三螺旋β-1,3-葡聚糖中的三螺旋结构几乎相同。这表明β-1,3-葡聚糖可以直接以三螺旋形式结合在GH64家族内切型β-1,3-葡聚糖酶的催化凹槽中。GH64家族β-1,3-葡聚糖酶与三螺旋β-1,3-葡聚糖底物的结合方式与植物病程相关抗真菌甜蛋白和β-1,3-葡聚糖螺旋糖链的结合方式相似，表明这是一种糖苷水解酶直接结合多糖四级结构底物的新型结合方式。

4 ）GH81家族内切型β-1,3-葡聚糖酶

GH81家族蛋白广泛分布于细菌、真菌、植物和古生菌中，且全部为内切型β-1,3-葡聚糖酶。到目前为止，已有3 种GH81家族β-1,3-葡聚糖酶的晶体结构得到解析，分别是来自耐盐芽孢杆菌（Bacillus halodurans）的BhGH81、来自热纤梭菌（Clostridium thermocellum）的CtLam81A和来自米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）的RmLam81A。GH81家族内切型β-1,3-葡聚糖酶由3 个结构域组成，其中N端结构域呈现β-折叠夹层结构，包含两组反向平行的β-折叠片层。C端结构域呈现典型的（α/α）6-桶状结构。N端和C端中间的小结构域包含2 个反向平行的β-折叠和2 个α-螺旋。3 个结构域共同组成了一条纵向的狭长催化凹槽（图6）。

研究表明RmLam81A可以结合三螺旋β-1,3-葡聚糖，遵循典型的反转型水解机制，通常是通过一步反应实现的，催化中心的保守天冬氨酸残基作为广义酸质子化糖苷键上的氧原子，而谷氨酸残基作为广义碱则对其去质子化，从而使糖苷键断裂完成水解过程。此外，该酶与多糖链的复合结构表明其至少能结合两个单独的β-1,3-葡聚糖链（图6B），这意味着该酶可能可以直接与三螺旋β-1,3-葡聚糖结合（图6C）。

3.2 外切型β-1,3-葡聚糖酶

外切型β-1,3-葡聚糖酶的水解模式是从β-1,3-葡聚糖糖链末端开始，依次切断糖链的β-1,3-糖苷键，产生葡萄糖或单一寡糖。已发现的外切型β-1,3-葡聚糖酶可以归属于6 个GH家族：GH3、GH5、GH17、GH55、GH128和GH132，其中大部分属于GH55以及GH5家族。目前GH5、GH55、GH128家族的外切型β-1,3-葡聚糖酶晶体结构均已得到解析，而GH3、GH17与GH132家族则鲜有结构解析。

GH55家族β-1,3-葡聚糖酶主要来源于细菌及真菌，且绝大部分属于外切型。GH55家族蛋白具有两个平行的右手β-螺旋结构域，构成一种类似于胸腔肋骨的结构，N末端和C末端的分别有7 个和10 个由右旋β-螺旋结构域组成的线圈，并通过一段氨基酸残基连接，该残基包括两个反向平行的β-折叠，催化位点位于两个结构域之间（图7A）。Bianchetti等发现来源于链霉菌的（Setreptomycessp.）的外切型β-1,3-葡聚糖酶（sacteLam55A），其底物复合物结构显示GH55家族外切型β-1,3-葡聚糖酶具有一个口袋型催化凹槽，具有6 个糖基结合位点，能够从糖链非还原末端逐一切下葡萄糖单糖（图7B）。GH55家族蛋白遵循反转催化机制，广义酸首先提供一个质子给底物异头碳，同时广义碱从水分子中夺走一个质子，增加了其亲核性，促进其攻击异头物的中心，从而断裂糖苷键，产生水解产物。

3.3 GH128家族β-1,3-葡聚糖酶

在近年的研究中，还发现了一些新型的β-1,3-葡聚糖酶，在CAZy数据库中归属于GH128家族。GH128家族β-1,3-葡聚糖酶属于GH-A超家族，具有碳水化合物结合区域和（α/β）8-桶状结构，且该桶状结构是所有已知GH128家族中最短的，平均仅有240 个氨基酸残基，该家族兼具内切型和外切型β-1,3-葡聚糖酶。

3.4 其他家族β-1,3-葡聚糖酶

除了上述家族典型的β-1,3-葡聚糖酶外，在GH3及GH5家族中也发现了少量的外切β-1,3-葡聚糖酶，它们具有典型的（β/α）8 TIM桶状结构，均遵循保留型催化机制。GH132家族β-1,3-葡聚糖酶被称为SUN-蛋白，被发现存在于丝状真菌和酵母中。目前关于GH132家族蛋白的相关报道较少，尚不清楚其蛋白结构和催化机理。GH158家族β-1,3-葡聚糖酶隶属于GH-A超家族，目前仅有一例GH158家族β-1,3-葡聚糖酶的结构解析被报道。

4β-1,3-葡聚糖酶的应用

4.1β-1,3-葡聚糖酶在抗真菌中的应用

果蔬在采后运输、贮藏和销售期间的腐烂、劣变等问题是影响果蔬品质、保存期和人体食用安全性的重要因素。由植物病原真菌引起的腐败是果蔬采后损失的主要原因。β-1,3-葡聚糖酶是生防微生物分泌的一种重要抑菌蛋白，植物自身在抵御真菌侵染过程中也会诱导产生β-1,3-葡聚糖酶。β-1,3-葡聚糖酶能够降解细胞壁β-1,3-葡聚糖糖链，致使病原菌菌丝断裂或畸形，造成病原真菌原生质泄漏，同时抑制其孢子萌发。基于β-1,3-葡聚糖酶的生物防治手段能够有效防治植物真菌病害，具有不产生抗药性、只针对靶标病原菌而不伤害其他有益生物、无农药残留、无毒无污染等优势。因此，探索β-1,3-葡聚糖酶在果蔬采后保鲜中的作用，发展基于β-1,3-葡聚糖酶的新型绿色生物防腐保鲜剂是果蔬绿色保鲜技术的潜在发展趋势之一。

4.2β-1,3-葡聚糖酶制备功能性低聚糖

β-1,3-葡寡糖也被称为昆布寡糖，是一种具有良好生物活性的食品功能因子，具有调节机体免疫力、抗感染、调节肠道菌群平衡等活性。由可得然多糖或昆布多糖水解制备的β-1,3-葡寡糖可作为一种新型益生元应用于功能食品开发。此外，一些小分子质量的可溶性β-1,3-低聚糖可以作为免疫激活剂诱导植物产生免疫反应，从而提高植物抗病性。而β-1,3-葡聚糖酶水解β-1,3-葡聚糖制备β-1,3-低聚糖具有特异性强且副产物少等优点，被认为是一种有潜力的低聚糖生产方法。

4.3β-1,3-葡聚糖酶酿酒工业中的应用

β-1,3-葡聚糖酶除了在抗真菌及寡糖制备中具有重要作用，还可以应用于酿酒工业中。在酿酒工业中，大麦是生产啤酒的主要原料，而生产加工过程中，某些微生物分泌到胞外的高聚β-1,3-葡聚糖增加了发酵液的黏度，造成过滤困难，最终可能在啤酒中形成絮状凝胶，使啤酒产量下降并增加酿酒成本。

4.4β-1,3-葡聚糖酶制备酵母原生质体

酵母菌细胞壁的主要化学成分是β-葡聚糖，一类是构成酵母菌细胞壁的骨架且含量较多的β-1,3-葡聚糖，另一类是起填充作用的含量较少的β-1,6-葡聚糖。制备酵母菌原生质体的关键在于分解细胞壁中不溶的β-1,3-葡聚糖，因此β-1,3-葡聚糖酶是制备原生质体的重要制剂。

4.5β-1,3-葡聚糖酶清除生物被膜

生物被膜是指由微生物和其胞外分泌物组成的复合组织。鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌等食品中关键的腐败菌会产生生物被膜，生物被膜会导致常用的消毒剂、抗生素的杀菌效果减弱，造成食品安全隐患。β-1,3-葡聚糖作为念珠酵母菌生物被膜的重要成分之一，在胞外基质发挥耐药性的过程中起到了重要作用。而β-1,3-葡聚糖酶在清除生物被膜方面具有一定功效，可以在食品工业中对腐败菌起到一定的控制作用。

4.6β-1,3-葡聚糖酶与几丁质酶协同作用

β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶均具有降解真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖和几丁质以及肽聚糖的作用，二者在防御植物病虫害方面具有广谱抗性，能够减少化学农药的使用，降低环境污染。

5 结 语

β-1,3-葡聚糖酶因能够特异性水解β-1,3-葡聚糖，在功能性寡糖制备、果蔬保鲜、生物医药、植物抗病等领域都具有重要的应用前景。目前研究者已对一系列不同家族β-1,3-葡聚糖酶的结构、功能及应用展开研究。在此背景下，如何获得具有良好应用性能的新型β-1,3-葡聚糖酶并实现其高效发酵制备，将是β-1,3-葡聚糖酶后续研究的重点。但由于天然β-1,3-葡聚糖底物的复杂性，现有β-1,3-葡聚糖酶对于不同类型底物的催化效率还有待进一步提高，部分不溶性β-1,3-葡聚糖底物的酶解仍然存在一定困难。此外，酶结构与功能的研究是探索酶催化机理、挖掘酶的催化特性以及进行酶分子改造研究的重要基础。针对天然β-1,3-葡聚糖底物的复杂性以及β-1,3-葡聚糖酶系的多样性，研究不同β-1,3-葡聚糖酶家族对于底物的结合差异和催化机理，明确β-1,3-葡聚糖酶对于复杂葡聚糖分子的底物识别机制，探索基于β-1,3-葡聚糖酶的多酶组合催化体系，是实现β-1,3-葡聚糖酶高效应用的发展趋势。

本文《β-1,3-葡聚糖酶的结构、功能及应用研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷15期269-277页. 作者：魏夏森，余赛男，张哲一，高海燕，秦臻. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220820-235.