2023年6月，哈佛大学公共卫生学院学者在《The Lancet Planetary Health》（1区，IF=28.75）发表题为：" Folate concentrations and serum perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substance concentrations in adolescents and adults in the USA (National Health and Nutrition Examination Study 2003–16): an observational study " 的研究论文。

这项研究基于2013-2016美国国家健康和营养检查调查（NHANES）的2802名青少年和9159名成年参与者数据，旨在探索血液中叶酸生物标志物浓度与PFAS浓度之间的关系。结果表明，在青少年和成人中，大多数检测的血清PFAS化合物与红细胞或血清中测量的叶酸浓度呈一致的负相关。这表明PFAS可能与叶酸竞争几种与PFAS毒性动力学相关的转运蛋白，这些发现可能对减少累积的PFAS身体负担和减轻相关不良健康影响的干预措施具有重要意义。

美国青少年和成年人的叶酸浓度和血清全氟烷基和多氟烷基物质浓度（NHANES2003-16）：一项观察性研究

摘要与主要结果

一、摘要

二、研究结果

1.基线特征

这项研究包括2802名青少年和9159名成年人，其中青少年的平均年龄为15.4±2.3岁，成人的平均年龄为44.5±17.5岁。青少年中的男性比例(53%)略高于成人(49%)。青少年平均BMI为24.1±6.3kg/m2，成人平均BMI为28.8±6.8kg/m2 。超过一半的人口是非西班牙裔白人，在青少年组(59%)和成人组(68%)。家庭收入低于贫困线的比例在青少年中(23%)高于成年人(14%)。

2.有向无环图

使用有向无环图先验地选择协变量作为潜在的混杂因素，最终纳入年龄、性别、种族和民族、收入与贫困比、BMI和调查周期。对于成人模型，我们额外调整了他们的最高教育水平。由于饮食质量与叶酸和PFAS暴露都相关，模型3对AHEI-2010评分进行了额外调整。

DAG，有向无环图(Directed Acyclic Graph，DAG)。这是一种理论驱动的自变量筛选方法，它基于理论的因果关系，构建因果关系网络，从而找到合适进入模型的自变量。

结合本文展示下DAG方法。本文包括若干个变量，包括：年龄、性别、种族和民族、收入与贫困比、BMI和调查周期、饮食。

上述自变量都可能影响结局，而且它们之间还相互影响。我们用箭头来表各自的因果关系，箭头发出对象为因，箭头指向为果(因→果)。 

通过DAG我们可以判断中介变量、混杂变量

①中介变量：比如Diet，对于age来说，它是处于age与Folate因果关系链上的中介变量。 

②混杂变量：比如age，它即影响Folate又影响PFAS，且不是两者的中介变量

3.多因素线性回归

在青少年中，协变量调整模型显示红细胞叶酸与血清PFOS和PFNA浓度以及血清叶酸和PFOS浓度之间呈负相关(见下表)。具体而言，红细胞叶酸浓度每增加2.7倍，血清PFOS浓度降低24.36% (95% CI - 33.21至- 14.34)，血清PFNA浓度降低13.00%(- 21.87至- 3.12)。血清叶酸浓度增加2.7倍与血清PFOS浓度下降11.57% (95% CI - 17.87 ~ - 4.79)相关。饮食质量的额外调整并没有改变这些发现(表2)。在青少年中，没有发现红细胞或血清叶酸浓度与其他PFAS化合物的关联。

这里之所以是2.7倍，是由于研究者对数据进行了对数转换，具体原理，下面统计方法处会再详细介绍

12-19岁青少年中叶酸生物标志物浓度每增加2.7倍，血清PFAS浓度的变化百分比

模型2根据年龄、性别和民族、种族、BMI、贫困收入比、调查周期进行调整。

模型3额外纳入了替代健康饮食指数2010得分(AHEI-2010评分)

在成年人中，红细胞叶酸和血清PFAS浓度之间的关联比青少年的发现更加一致。红血球叶酸浓度与成人血清中的PFOS和PFNA浓度有很强的关联。具体来说，在调整协变量后，红细胞叶酸浓度增加2.7倍与血清PFOS浓度降低25.30% (95% CI - 29.67至- 20.65)和血清PFNA浓度降低21.65%(- 26.19至- 16.82)相关。红细胞叶酸浓度也与血清PFOA(百分比变化- 12.45%，95% CI - 17.28 ~ - 7.35)和PFHxS(- 11.70%， - 17.32 ~ 5.70)浓度呈负相关。与红细胞叶酸浓度相比，PFAS浓度与血清叶酸浓度的相关性一般较弱。血清叶酸浓度与PFOA(百分比变化为- 5.01%，95% CI为- 8.35 ~ - 1.54)、PFOS(- 12.81%， - 16.15 ~ - 9.35)、PFNA(- 11.85%， - 14.72 ~ - 8.88)、PFHxS(- 1.72%， - 6.65 ~ 3.46)呈负相关。此外，调整饮食质量并没有改变研究结果。

成人中叶酸生物标志物浓度每增加2.7倍，血清PFAS浓度的变化百分比

模型2根据年龄、性别和民族、种族和民族、体重指数、贫困收入比、教育水平、调查周期进行调整。

模型3额外纳入了替代健康饮食指数2010得分

4.分层分析

在按性别进行分层分析后，在青少年中，红细胞叶酸、PFOS和PFNA以及血清叶酸和PFOS之间没有发现一致的性别异质性。

在肥胖青少年中，红细胞叶酸和血清叶酸与PFOS浓度的负相关程度更强，而在肥胖青少年和非肥胖青少年中，红细胞叶酸和PFNA之间的关联相似。

相比之下，在成年人中，叶酸生物标志物和PFAS浓度之间的相关性在女性和非肥胖成年人中略强。所有四种PFAS化合物与红细胞叶酸、PFOA与血清叶酸之间的关联在女性参与者中更强，而PFOS和PFNA与血清叶酸的相关性在男性和女性参与者中是相似的。在主要分析中，与肥胖的成年人相比，无肥胖的成年人与肥胖的成年人之间的相关性也略强。

5.限制性立方样条图(RCS)

限制性立方样条图显示，青少年红细胞与血清叶酸和PFAS浓度之间的线性关系略有下降。叶酸生物标志物和PFAS浓度之间的其他剂量-反应关系在青少年中表现一般。

天然对数转化叶酸(血清和红细胞)与血清PFAS浓度的剂量-反应关系（青少年）

在成人中，红细胞叶酸浓度与所有四种血清PFAS血清浓度呈明显的线性负相关，而成人血清叶酸浓度与PFOS和PFNA浓度呈反u型关系。

天然对数转化叶酸(血清和红细胞)与血清PFAS浓度的剂量-反应关系（成人）

RCS可以刻画连续性自变量和因变量之间的剂量反应关系，检验剂量反应关系是否线性。事实上，大多数的回归模型有一个重要的假设就是自变量和因变量呈线性关联，这个条件实际很难满足，而RCS是拟合自变量与因变量之间的非线性关系的最常见方法之一。这里作为补充方法验证多因素线性回归结果。

设计与统计学方法

一、研究设计

P（Population）参与者：NHANES数据库中2013-2016年参与调查的2802名青少年和9159名成年人

E（exposure）暴露因素：叶酸浓度(血清和红细胞)

O（outcome）结局：血清PFAS浓度

S（Study design）研究类型：观察性研究

二、统计方法

1.描述性统计计算了参与者特征、叶酸生物标志物和PFAS化合物的分布。由于年龄异质性的潜在影响，我们将青少年(12-19岁)和成人(≥20岁)的分析分开。

2.红细胞和血清中的叶酸浓度以及血清中的PFAS浓度进行了自然对数转换，以尽量减少异常值的影响，并改善对相关结果的解释。我们应用多因素线性回归模型，对青少年和成人进行协变量调整后，检测每2.7倍增加(即自然对数转化的每单位增加)叶酸浓度(在红细胞和血清中)，单个PFAS化合物的血清浓度变化百分比。

这里研究者为了减少异常值的影响，对数据进行了自然对数转换，具体原理如下：

对数转换即X1→lnX2

X1:1、2、3、4、5、6......

X2:e^1、e^2、e^3、e^4、e^5、e^6......

则X1每变化1个单位，X2变化e，而e≈2.7181

3.由于补充叶酸可以直接改变叶酸而不是PFAS浓度，因此叶酸和PFAS浓度的相关性在摄入或不摄入叶酸的参与者中可能有所不同。我们对在两次饮食访谈中至少有一次报告叶酸补充摄入量的参与者与没有报告叶酸补充摄入量的参与者进行了分层分析。此外，我们还研究了青少年和成人中叶酸生物标志物和个体PFAS化合物的相关性在性别和肥胖方面的效应异质性。

4.使用限制性立方样条图来探索叶酸生物标志物与青少年和成人个体PFAS化合物浓度之间的关系。(R包：splines)

5.描述性分析和关联分析都遵循NHANES统计分析协议，为了获得具有全国代表性的统计数据我们在分析中考虑了研究抽样方案、数据聚类和子样本权重。软件使用R 4.0.3版本、SAS版本9.4。

小结

本篇文章主要分析两定量数据的相关关系，主方法采用了多变量线性回归。但是在自变量筛选中，并没有像常规文章一样采用先单后多常规方法，而是选用了DAG来进行混杂因素的筛选，这一点比较值得借鉴！

在本篇研究中还涉及到了限制性立方样条图，在多变量线性回归中已经证明了青少年中红细胞叶酸与血清PFOS浓度以及血清叶酸和PFOS浓度之间呈负相关，成年人更甚。在这里RCS更多是作为次方法进行补充验证，其结果与多变量线性回归大体相同。

事实上，限制性立方样条的应用范围非常广，凡是想描述自变量和因变量的关系都可以在回归模型中加入限制性立方样条，除了以上的例子中的线性回归外，还可以应用到cox回归、Logistic回归、以及Meta分析中剂量反应关系的Meta回归等。

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