一看就会,细胞分离 5 大常见问题深度解疑 |
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小师妹 可是师兄!分离后发现得到的淋巴细胞中有较多红细胞污染咋回事? 师兄 师妹,你有没有控制离心时的温度?离心机温度太低可能导致这样的情况发生。Ficoll-Paque 是一种密度梯度离心介质。在低温条件下,Ficoll-Paque 的密度较高,因而红细胞的聚集效果比较差,离心时红细胞和粒细胞不能很好地穿透 Ficoll-Paque 层而造成分离后的淋巴细胞有红细胞污染。合适的分离温度应保持在 18~20 ℃。 小师妹 完了!芭比 Q 了!我一直都是用的低温离心,维持细胞活性......师兄你在分离单核细胞的时候还有什么经验,快把绝招分享给我! 师兄 那我可得跟你唠唠了!目前我们实验室用到的细胞分离产品主要分 Percoll 和 Ficoll 两种...... ( 除了干货内容,文章结尾还有惊喜促销哦) 请输入文字 图注:Percoll 密度梯度培养基 图注:Ficoll 密度梯度培养基 Percoll 的应用范围较广,不仅仅适于分离多种属不同密度的细胞,还可分离亚细胞器和病毒,可实现从 1.0~1.3 g/ml 范围内的密度梯度离心分离。Ficoll 主要有 3 种密度,1.073、1.077、1.084 g/ml,主要用于人血,骨髓,以及脐带血中一些单核细胞、间充质干细胞的分离。Ficoll(1.084 g/ml)主要用于小鼠或大鼠血液淋巴细胞分离。 上述信息简而言之,以表格的形式呈现如下: 接下来就分享 5 个细胞密度梯度分离液操作小 Tips: 1. Ficoll 分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell,PBMC),血小板污染比较多,如何改善? 可以从以下六个方面降低血小板的污染: (1)不管用哪种离心管,都需要严格保持样品的高度/ficoll 的高度比为 3/2.4; (2)离心温度应控制在 18~20 ℃; (3)取目的层样品时,需先将上层溶液去掉,再吸取目的层; (4)增加分离后的洗涤步骤; (5)分离后洗涤时,可以在较低的离心力情况下(比如 200 g)进行离心处理,血小板密度比较低,会留在血浆中,PBMC 在沉淀里,通过这一操作可以除掉一部分血小板; (6) 考虑起始血液样品本身是否正常、是否新鲜。 2. Ficoll-Paque PLUS 分离人外周血中的淋巴细胞,为何淋巴细胞产量低 、活力低且出现其它类型细胞污染? 多半是由于样品含有非正常密度的细胞。这些细胞的密度不同于那些来自正常人血液中细胞的密度,比如非正常血液样品、非人血液样品,或非外周血来源的样品。在这些情景下,Percoll 可能比 Ficoll-Paque PLUS 更加适合此类样本的分离。 3. Ficoll 分离人外周血中的淋巴细胞,为何淋巴细胞产量低但活力正常 ? 在分离时,未用平衡盐溶液将血液稀释到 1:1;通常情况下,红细胞比容较高,高细胞密度导致大量的淋巴细胞陷入红细胞团块中,此时应进一步稀释血液样品。 4. Ficoll 分离人外周血中的淋巴细胞,为何淋巴细胞低产量且粒细胞污染增加? 可能是由于离心机转子振动,导致梯度混合。离心机转子振动可能导致淋巴细胞带的增宽,与下层细胞混合。应先检查转子是否已平衡,再选择合适的转速,以避免自发共振频率。 5. Percoll 的配制方法有哪些? (1)按照百分比用两步法计算:用一份的 1.5M NaCl 或者 2.5M 蔗糖加九份 Percoll 原液,得到 100% 的 SIP 溶液。在此基础上,比如想要得到 44% 和 67% 的工作液,分别按 0.15M 的 NaCl 或者 0.25M 的蔗糖:SIP =(100~44):44 和(100~67):67 的比例取相应体积的溶液进行配制即可。 (2)根据密度进行一步法计算,该计算方法需要知道最终配制的溶液的密度、细胞分离液的密度(Percoll 密度范围 1.130 ± 0.005 g/ml,具体密度可根据批次号在 Cytiva 官网中查询 COA 获得),以及用于稀释的 buffer 的密度(1.5M 的 NaCl 密度为 1.058 g/ml,2.5M 的蔗糖的浓度为 1.316 g/ml),推荐官网的计算小程序,链接如下: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/support/online-tools/cell-preparation/Percoll-calculator 小师妹 谢谢师兄,小本本都记好了! 心动不如行动吧! 师兄 细胞密度梯度分离液产品促销 火热进行中 关于开学季优惠券小贴士 问 优惠券都有哪些?如何查找? 答 方法一:扫描上方海报上的二维码,即可进入优惠券列表汇总页。可以通过上下页翻页浏览详情,还可通过点击左上角分类或在搜索框中输入关键词,进行快速筛选查找。 方法二:进入 Cytiva 服务号,点击菜单 【Cytiva 服务】-【开学季优惠券】即可进入优惠券列表汇总页。(后续查找方式同上) 问 如何申领优惠券? 答 1. 首先选择您心仪的优惠券点击进入,即可了解更多详细内容及优惠券使用规则 2. 点击 【立即领取】后,进去领取信息确认页面,补充和修改您的基本信息 3. 最后点击 【确认提交】即可完成申领 内容审核:王丹琦 项目审核:周育红 题图来源:图虫创意
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