舒适无菌的环境是细胞健康生活的重要基础。如下图为培养细胞的器皿，包括形状、规格、用途多样的培养瓶、培养皿及培养板。最终住进37℃，5%CO2的恒温培养箱。

常见问题解答：

Q：细胞培养板规格不一，如何正确选用?

A：根据不同规格的细胞培养皿/板容量及用途，如流式一般用 6 孔，爬片一般用 24 孔，MTT 一般用 96 孔等，具体信息如下图所示：

Q：细胞培养皿和培养瓶区别?

A：就细胞培养状态来说，培养瓶和培养皿没有太大区别，主要在于安全系数(培养瓶>培养皿)、培养细胞数量(大培养瓶>培养皿)。但是培养瓶成本也会相对较高，因此无特殊要求，一般选择培养皿即可。

三、细胞的复苏与冻存(原则是慢冻速融)

1. 细胞复苏：指将冻存的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。

复苏过程如下图所示：

常见问题解答：

Q：为什么细胞复苏后，很多难以贴壁?

A：忽略培养基的问题，主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。

Q：为什么细胞贴壁了，却长不起来?

A：此时需要考虑的是细胞密度问题，一些细胞倾向于维持一定的密度，若复苏的细胞生长缓慢，可将细胞转移到较小的培养瓶/皿中培养。

2. 细胞冻存 将细胞放在低温环境(-70℃~-196℃)，细胞内的代谢降低，可最大限度的保存细胞活力，以便长期储存。

常见问题解答：

Q：目前细胞冻存液多采用的什么配方?

A：目前细胞冻存多采用DMSO二甲基亚砜或甘油作保护剂，细胞冻存液的配方有很多种，如培养基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，复苏存活率在80%～90%以上。

Q：若没有细胞冻存盒，我们该怎么办?

A：可先将冻存管放入4℃冰箱中10min，再移至-20℃冰箱30min，-80℃冰箱2h或过夜，最后放入液氮罐内。为了节约时间，还可直接在冻存盒外包裹一团棉花，用棉花代替冻存盒缓慢降温的特点，将细胞转移至-80℃冰箱过夜，再转移至液氮保存。

Q：细胞冻存时对细胞量有要求吗?

A：细胞复苏时会有一定的细胞死亡，因此细胞的浓度应足够高，起始浓度106—107个/ml/管;

四、细胞的传代培养

细胞传代：细胞在培养过程中不断增殖，培养皿/瓶空间有限，当细胞接触过密，生长就会受到抑制，影响细胞状态，因此我们要把其中一部分细胞分到别的培养皿/瓶里。

常见问题解答：

Q：为什么我们总说选择对数期细胞传代?

A：如下图：细胞的生长和分裂，一般遵循以下模式：停滞期，对数期(指数期)，平稳期(平台期)和衰退期。为了确保活力，遗传稳定性和表型稳定，必须使细胞保持在对数期。

Q：那如何确定细胞对数期?

A：根据上述细胞生长曲线，为了确保活力，必须使细胞保持在对数期就传代，所以一定不能等到细胞长满100%融合时才去消化传代。一般细胞长到 70% -80%左右即可传代。

Q：一般细胞传代都是1分2吗?

A：要根据不同细胞而定，如有的生长很快，比如说4T1细胞，传代取离心悬液的十分之一就已经足够了。有的又特别慢，比如 BT474。此时我们就要多观察摸索最合适的传代比例。

Q：消化很关键吗?

A：不得不说，细胞状态差，很多时候与传代时胰酶消化密切相关。一般肿瘤细胞消化1-2min即可。但是每一种细胞贴壁能力不同，因此对胰酶的反应也不同，我们需要密切跟踪。一般肉眼观察到贴壁细胞层能移动即可终止;而非细胞全部分散成单个。如下图分别是正确和错误的消化时间：

Q：部分比较难消化的细胞怎么办?

A：可放于37℃培养箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受细胞为例，放于37℃培养箱消化5-8min，轻轻拍打，才见细胞成片移动，因此针对难消化细胞一定要在显微镜下密切观察。

Q：几天换培养基?

A：正常情况下，培养液偏红色。如果细胞维持在pH6.5～6.6条件下，培养基变黄，说明培养液中代谢产物已堆积到一定量，细胞会脱落死亡，需要更换新鲜培养液。一般细胞生长旺盛时1～2天换一次，生长缓慢时，3～4天亦可。针对复苏后的细胞，建议隔天换液。

Q：每天观察细胞有必要吗?

A：一般的肿瘤细胞我们是隔天传代，但是切不可忽略对细胞的观察，一定要每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。记住，是每天。

Q：如果细胞形态不清晰或有异物等，如何处理?

A：可以考虑如下操作：首先，倒掉旧的培养基，用新的培养基或者PBS洗涤2-3次，再开始正式的消化、吹打。其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内。后续再密切观察。

Q：细胞污染怎么办?

A：如发现细胞有污染，一般建议丢弃。如果细胞非常宝贵，可试着加入含抗生素的培养基反复清洗，并用抗生素含量高的培养基培养，并经常更换培养基;

本期的内容就介绍到这里了，细胞培养是后续实验的基石，看似简单的传代却有着大学问，希望大家在实践操作中，可以结合我们为大家提供的小细节，多多联系和摸索，相信你的细胞会养的更加漂亮!返回搜狐，查看更多