·论 著·

张 霞，程晓叶，廖 曼，张玉倩，张兰桐*，樊淑彦

(河北医科大学药学院药物分析教研室，河北 石家庄 050017)

[摘要]目的建立高效液相色谱法(high efficiency liquid chromatography,HPLC)同时测定明目上清片中4种化学成分(大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚)的含量以及降脂宁片中二苯乙烯苷的含量。方法明目上清片采用Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-四氢呋喃-1%磷酸(84∶7∶9)为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，进样量20 μL；降脂宁片采用Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%磷酸为流动相等度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长320 nm，进样量20 μL。结果大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚分别在0.500～4.00(r=0.999 3)、0.370～2.96(r=0.999 0)、1.10～8.80(r=0.999 1)、1.00～8.00 (r=0.999 3) ng范围内呈良好线性关系，回归方程分别为Y=8.60×103+9.62×104X、Y=-1.16×104+1.20×105X、Y=7.41×103+1.20×105X、Y=4.13×103+6.91×104X；二苯乙烯苷在0.218～1.31 μg范围内线性关系良好(r=0.998 8)，回归方程为Y=-6.33+3.18×103X。明目上清片含量测定的平均回收率分别为97.8%、97.8%、98.7%和99.5%，相对标准差(relative standard deviation，RSD)(n=6)分别为1.2%、0.89%、1.7%和1.7%；降脂宁片的平均回收率为96.6%，RSD(n=6)=0.65%。结论该方法简便快速，准确度高，专属性好，可以用于明目上清片以及降脂宁片的质量控制。

[关键词]大黄酸；二苯乙烯苷；色谱法，反相

明目上清片由黄芩、黄连、熟大黄、桔梗、天花粉、石膏、麦冬等21味中药材加工制成，具有清热散风、明目止痛的功效，用于暴发火眼、红肿作痛、头晕目眩、眼边刺痒、大便燥结、小便赤黄等症状[1]。明目上清片现收录于2015年版《中国药典》第一部[2]，其项下测定黄连的有效成分盐酸小檗碱。明目上清片中的被测4种成分均属于蒽醌类化合物，且均具有抗菌、抗衰老等药理作用。文献报道测定明目上清片中黄芩苷的含量[3]及橙皮苷的含量[4]，并且有关文献报道高效液相色谱法(high efficiency liquid chromatography,HPLC)同时测定明目上清片中的10种成分，其中包括大黄素、大黄酚[2]。由于只监测中药复方制剂中的一种指标成分不能有效控制其质量，故本研究建立了HPLC同时测定明目上清片中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量。 降脂宁片由制何首乌、山楂(去核)、荷叶、决明子等4味中药组成，其功效是软化血管、降血脂，用于高血脂、心律不齐和增强冠状动脉血液循环等症。降脂宁颗粒标准简单，且无含量测定项[5]。有文献报道测定降脂宁片中的葛根素[6]及大黄素的含量[5]。制何首乌是降脂宁片的主要成分，且具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨之功效，二苯乙烯苷是制何首乌中的主要成分。本研究建立了HPLC测定降脂宁片中二苯乙烯苷的含量。结果表明以上方法简便可靠、灵敏迅速，成本及工作量降低，现报告如下。

1.1 仪器 高效液相色谱仪，LC98-Ⅱ型，UV98-Ⅱ可变波长紫外可见分光检测器，P98-Ⅱ高压输液泵，T-98型柱温箱，北京温分分析仪器技术开发有限公司；N-2000双通道色谱工作站，浙江大学智能信息工程研究所；TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。美国 Aligent 1200 高效液相色谱仪，包括四元泵、柱温箱、自动控温进样器、二极管阵列检测器(DAD)，Agilent 化学工作站。

1.2 药品 明目上清片(长春海外制药集团有限公司，批号22020997)；大黄酸(批号110757-200206)、大黄素(批号110756-200110)、大黄酚(批号110796-200615)、大黄素甲醚(批号110758-200610)和二苯乙烯苷对照品(批号0844-1005)均购自于中国食品药品检定研究院；降脂宁片(长春万德制药有限公司，批号20120801、20140101、20140201)；甲醇为色谱纯，水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

1.3 色谱条件 色谱柱Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，波长254 nm，流动相为甲醇-四氢呋喃-1%磷酸 (84∶7∶9)，进样量20 μL，流速为1.0 mL/min， 柱温25 ℃。分别取混合对照品溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液进去色谱仪在上述色谱条件下进样，记录色谱图。1～4的保留时间分别约为4、6、8和10 min，分离度均>1.5，理论塔板数均>10 000。阴性对照不干扰含量测定。

色谱柱Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，波长320 nm，流动相为甲醇A-0.1%磷酸B(35∶65)，进样量20 μL，流速为1.0 mL/min，柱温25 ℃。按上述色谱条件，分别吸取对照品溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液进入高效液相色谱仪，记录色谱图。二苯乙烯苷的保留时间约为17 min，分离度>1.5，理论塔板数>10 000。阴性对照不干扰含量测定。

1.4 溶液的制备

1.4.1 混合对照品溶液 精密称取大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量，分别置25 mL量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度。得到浓度分别为25、18.5、55和50 mg/L的对照品储备液。分别精密量取大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品储备液2 mL，置同一10 mL量瓶中，用甲醇定容，得到大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚浓度分别为5.0、3.7、11、和10 mg/L的混合对照品溶液。精密称取二苯乙烯苷对照品适量，置25 mL量瓶中，加入适量的甲醇溶解稀释，用甲醇定容，得到浓度为43.5 mg/L的对照品溶液。

1.4.2 供试品溶液 取明目上清片20片，去糖衣，研细，称取粉末约1.0 g，精密称定，置50 mL的具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇25 mL，精密称定，超声30 min冷却，用95%乙醇补足减失的质量，静置，滤过，精密量取续滤液10 mL，置烧瓶中，水浴蒸干，精密加入30%乙醇-盐酸溶液(10∶1)溶液15 mL，置水浴加热水解1 h，立即冷却，用氯仿强力振摇提取4次，每次15 mL，合并氯仿液，置水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，移置25 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

取降脂宁片20片，去薄膜衣，精密称定，研细，称取粉末约1.0 g，精密称定，置50 mL的具塞锥形瓶中，加入75%甲醇25 mL，精密称定，超声30 min，冷却，用75%甲醇补足减失的质量，静置，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

1.4.3 阴性样品溶液 按照处方比例，取桔梗、天花粉、石膏、麦冬和玄参等适量，按照制剂工艺制备缺熟大黄的空白样品，再按照“1.4.2”项下方法制备阴性对照溶液。

按照处方比例，取山楂(去核)、决明子、荷叶适量，按照制剂工艺制备缺制何首乌的空白样品，再按照“1.4.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.1 标准曲线的绘制 精密量取明目上清片混合对照品溶液0.5、1、2、3、4 mL，分别置5 mL量瓶中，用甲醇定容，得到大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品的浓度范围为0.500～4.00、0.370～2.96、1.10～8.80和1.00～8.00 mg/L，按照“1.3”项下色谱条件，分别进样20 μL，记录色谱图，分别以1～4的浓度为X/c(mg/L)为横坐标，峰面积为纵坐标Y，进行线性回归。得回归方程见表1。

表1 4种化合物回归方程以及相关系数Table 1 Regression equation and correlation coefficient of four kinds of compound

化合物线性范围(mg/L)回归方程r10．500～4．00Y=8．60×103+9．62×104X0．999320．370～2．96Y=-1．16×104+1．20×105X0．999031．10～8．80Y=7．41×103+1．20×105X0．999141．00～8．00Y=4．13×103+6．91×104X0．9993

取降脂宁片对照品溶液，按照“1.3”项下色谱条件，分别进样5、10、15、20、30、40 μL。记录色谱图，以进样量为X(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程见表2。

表2 二苯乙烯苷的回归方程以及相关系数Table 2 Regression equation and correlation coefficient of stibene glucoside

化合物线性范围(μg)回归方程r二苯乙烯苷0．218～1．31Y=-6．33+3．18×103X0．9988

2.2 精密度试验 精密吸取同一明目上清片供试品溶液，以上述色谱条件连续进样5次，计算大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的相对标准差(relative standard deviation ，RSD)(n=5)分别为1.6%、1.2%、0.85%和0.94%。表明仪器精密度良好。

精密吸取降脂宁片同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样5次，记录色谱峰面积，得到二苯乙烯苷的峰面积RSD=0.86%(n=5)。

2.3 稳定性试验 精密吸取同一明目上清片供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8、12、24 h，分别进样20 μL。计算大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD值(n=5)分别为1.6%、0.63%、2.2%和1.5%。表明供试品溶液中的4个待测成分在室温放置24 h 内基本稳定。

取样品粉末(降脂宁片)1.0 g，精密称定，按照“1.4.2”项下配制供试品，于0、2、4、8和12 h进样测定，二苯乙烯苷的的峰面积RSD=0.76%(n=5)。表明供试品溶液的待测成分二苯乙烯苷在室温下12 h内稳定。

2.4 重复性试验 取同一批号明目上清片样品1 g，精密称取5 份，分别按“1.4. 2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别进样20 μL。计算样品中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均含量分别为50.5、93.6、170和70.6 μg/g，RSD(n=5)分别为2.0%、1.9%、1.8%和2.1%。表明方法重复性良好。

取同一批降脂宁片样品(批号20120801)5份，每份1.0 g，精密称定，分别采用“1.4.2”项下的方法配制供试品溶液，进样测定，二苯乙烯苷的平均含量为630 μg/g，RSD为0.30%(n=5)。

2.5 回收率试验 采用加样回收法。取已测定的同一批次的明目上清片样品6份，每份0.5 g，精密称定，置500 mL 圆底烧瓶中，分别加入各组分的对照品适量，按“1.4.2”项下方法制备供试溶液，在上述色谱条件下分别进样20 μL，计算回收率。结果大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均回收率分别为97.8%、97.8%、98.7%和99. 5%，RSD(n=6)分别为1.2%、0.89%、1.7%和1.7%。

取已知含量的降脂宁20片(批号20120801)，研细后精密称取6份，每份0.5 g，加入二苯乙烯苷对照品溶液适量，按照“1.4.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，按外标法计算得二苯乙烯苷的平均回收率96.6%，RSD=0.65%(n=6)。

2.6 样品含量测定 取3批次明目上清片各1 份，分别按照“1.4.2”项下方法制备供试品溶液(明目上清片)，按上述色谱条件分别进样20 μL，进行测定，以外标法计算1～4含量，结果见表3。

取3批样品，按“1.4.2”项下方法制备供试品溶液(降脂宁片)，分别进样测定，按外标法计算二苯乙烯苷的含量，结果见表4。

表3 4种待测成分含量测定结果Table 3 Determination of four kinds of compound (n=3，μg/g)

批号12342012010150．494．716970．22012070151．295．217171．52013040249．994．417070．1

表4 二苯乙烯苷的含量测定结果Table 4 Determination of stibene glucoside (n=3，μg/g)

批号201308012014010120140201二苯乙烯苷620613622

3.1 提取工艺的确定 分别采用加热回流、超声提取等方法对明目上清片中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚4种成分的提取效率的考察，结果表明超声和回流提取待测成分得到相似的提取效率，且超声提取方法简便快速，故选用超声提取；根据相关文献[7-8]，又进一步考察不同浓度的提取溶剂乙醇即25%、50%、75%和95%，结果表明低浓度的乙醇提取不完全，故选择95%的乙醇作为提取溶剂。而且还进一步考察超声10、20、30、40和50 min处理待测样品，结果表明30 min后，4种指标成分已基本提取完全，故将30 min作为最佳超声提取时间。

考察降脂宁片中二苯乙烯苷的提取效率，结果选择超声提取，采用75%甲醇提取[9]；同时对比不同超声时间20、25、30、35 和40 min，显示超声时间为30 min的待测组分峰面积达到峰值，30 min后各组分峰面积均变化不大，故选择30 min为最佳提取时间。

3.2 测定波长的选择 明目上清片中的4种待测成分均在254 nm处有最大紫外吸收波长，且254 nm检测时各成分峰形最佳，分离度好，故选择254 nm为检测波长[10-12]。二苯乙烯苷的最大吸收波长为320 nm，故选择320 nm为检测波长[13-16]。

3.3 流动相的选择 HPLC测定大黄酸、大黄素等含量常用流动相是不同比例的甲醇-1%磷酸系统，也有采用甲醇-冰醋酸，乙腈-0.2%磷酸等系统[12，17-18]，由于乙腈毒性大，故采用甲醇。在实验中改变流动相中甲醇、四氢呋喃和1%磷酸缓冲液的配比，最终确定流动相为甲醇-四氢呋喃-1%磷酸(84∶7∶9)。

根据相关文献[16, 19-23]，HPLC测定二苯乙烯苷含量常用流动相甲醇-水、乙腈-水系统，结果发现2种流动相系统对待测组分的分离影响无显著性差异，考虑到乙腈的毒性较大且经济成本较高，故选择甲醇-水流动相系统。进一步考察磷酸对待测组分的影响，分别加入0.05%、0.1%和0.15%的磷酸，结果显示添加0.1%磷酸后，峰形得到了改善且基线稳定，分离度良好，故确定以甲醇-0.1%磷酸为流动相。

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(本文编辑：许卓文)

Simultaneous determination of rhein,emodin, chryophanol,physcion and stibene glucoside in compound preparations by HPLC

ZHANG Xia, CHENG Xiao-ye, LIAO Man, ZHANG Yu-qian, ZHANG Lan-tong*, FAN Shu-yan

(Department of Pharmaceutical Analysis,School of Pharmacy,Hebei Medical University,Shijiazhuang050017,China)

[Abstract]Objective To develop an analysis method for Rhein, Emodin, Chrysophanol and Physcion in Mingmu Shangqing tablets and stibene glucoside in Jiangzhining tablets by high efficiency liquid chromatography(HPLC). Methods The four constituents of Mingmu Shangqing tablets were separated on Kromasil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) using a mobile phase consisted of methanol-tetrahydrofuran-1% phosphoric acid in water at the detection wavelength of 254 nm. The constituent stibene glucoside in Jiangzhining tablets was separated on Kromasil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) using a mobile phase consisted of methanol 0.1% phosphoric acid in water at the detection wavelength of 320 nm. Results Rhein, Emodin, Chrysophanol and Physcionhad had a good liner relationship within the scope of 0.500 to 4.00(r=0.999 3), 0.370 to 2.96(r=0.999 0), 1.10 to 8.80(r=0.999 0), 1.00 to 8.00(r=0.999 0) ng, respectively. And their regression equation were Y=8.60×103+9.62×104X, Y=-1.16×104+1.20×105X, Y=7.41×103+1.20×105X, Y=4.13×103+6.91×104X, respectively. The average recoveries(n=6)were 97.8%， 97.8%， 98.7%， 99.5% and with relative standard deviation(RSD)(n=6) of 1.2%， 0.89%， 1.7%， 1.7%. Stibene glucoside had a good liner relationship within the scope of 0.218 to 1.31 ng(r=0.999 0). The regression equation was Y=-6.33+3.18×103X. The average recoveries were 96.6% and with RSD of 0.65%. Conclusion The method is rapid,simple,accurate and with good reproducibility and can be used in quality control of Mingmu Shangqing tablets and Jiangzhining tablets.

[Key words]Rhein; stibene glucoside; chromatography, reverse-phase

[收稿日期]2016-01-27；

[修回日期]2016-02-24

[作者简介]张霞(1991-)，女，河北衡水人，河北医科大学药学院药理学硕士研究生，从事药物分析研究。

*通讯作者。E-mail: [email protected]

[中图分类号]R944

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2017)02-0201-05

doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2017.02.019