1.本技术涉及番茄作物技术领域，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌、番茄用复合微生物肥料、制备方法及其应用。

背景技术：

2.番茄中含有大量的维生素和番茄红素，其中每100克番茄中含近20毫克维生素c，而番茄红素也成为番茄受欢迎的主要原因之一，其具有十分强的抗氧化性，对于抗衰老以及男性前列腺疾病均有较好的效果。番茄主要的病害有真菌性枯萎病、早、晚疫病、灰霉病、叶霉病；病毒性病害；细菌型的枯萎病、斑枯病以及生理性病害，对番茄生产影响较大，特别是在设施栽培中，病害植前土壤化学消毒，这些都可能引起化学农药过量使用所带来的环境风险，而且也引起病源菌耐受性的增加，使病害防治越来越难，形成恶性循环。

技术实现要素：

3.有鉴于此，本技术的目的在于至少提供一种复合微生物肥料，以将其应用于番茄生产中，不仅为番茄提供营养，同时对番茄病害具有很好的预防作用，可以减少使用化学农药引起的环境污染风险，同进可以缓解土壤障碍因子对番茄生产的制约。4.第一方面，本技术实施例公开了一株枯草芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m2021996，分类命名为枯草芽抱杆菌bacillus subtilis qk‑1，保藏日期为2021年08月06，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。5.第二方面，本技术实施例公开了一种番茄用复合微生物肥料，包含浓度不低于0.2亿/g的第一方面所述的枯草芽孢杆菌、不低于20wt％的有机质、不低于8wt％的n‑p2o5‑k2o、1～2wt％的中微量元素、2‑5wt％的cao和1‑2wt％的mgo。6.第三方面，本技术实施例公开了复合微生物肥料的制备方法，包括以下步骤：7.将所述枯草芽孢杆菌bacillus subtilis qk‑1进行发酵培养至活菌数不低于7亿/ml、芽孢率达90％即可停止发酵，收集发酵液，离心去除上清液，得到浓缩的菌液备用；8.腐殖酸和生物炭与浓缩后的菌液混合均匀后，一起加入至蚯蚓粪中，继续培养48h，得到培养物；9.向上述培养物中添加氨基酸钙、氨基酸镁、磷肥和钾肥，混合均匀即可得到所述番茄用复合微生物肥料。10.在本技术实施例中，所述腐殖酸和所述生物炭的加入量均为所述蚯蚓粪重量的1wt％。11.在本技术实施例中，所述氨基酸钙和所述氨基酸镁的加入量均为所述蚯蚓粪重量的1wt％，所述磷肥的加入量为所述蚯蚓粪重量的3wt％，所述钾肥的加入量为所述蚯蚓粪重量的2wt％。12.第四方面，本技术实施例还公开了第一方面涉及的枯草芽孢杆菌、第二方面所述的复合微生物肥料、或第三方面制备方法制得的复合微生物肥料在番茄幼苗培育中的应用。13.第五方面，本技术实施例还公开了第一方面涉及的枯草芽孢杆菌在抗番茄尖镰孢菌(fusarium oxysporum.f.sp.cucmrium)或青枯假单胞菌(pseudo‑monas sollamacearum)中的应用。14.与现有技术相比，本技术实施例至少具有以下有益效果：15.本技术中涉及的枯草芽孢杆菌，来源于蚯蚓粪，可对番茄尖镰孢菌和青枯假单胞菌产生拮抗作用，在番茄抗病害中发挥关键作用；同时将该菌再返回定植于蚯蚓粪中繁殖，形成专用优势菌株，提高了菌种的质量和数量；添加螯合的中量mg、ca元素及适量的磷钾元素，制备成复合微生物肥料，该复合微生物肥料不仅能够帮助番茄抵抗枯萎病，青枯病等病害，还能提供番茄生长所需的营养成分，促进番茄生长。附图说明16.图1为本技术实施例提供的①号菌对番茄枯萎病病原菌的抑菌效果图；左图为枯萎病病原菌平板，右图为①号菌与枯萎病病原菌共培养平板(中间为病原菌菌斑)。17.图2为本技术实施例提供的②号菌对番茄枯萎病病原菌的抑菌效果图；左图为枯萎病病原菌平板，右图为②号菌与枯萎病病原菌共培养平板(中间为病原菌菌斑)。18.图3为本技术实施例提供的①菌对番茄青枯病菌病原菌抑菌效果；右图为青枯病菌病原菌平板，左图为①号菌与青枯病菌病原菌共培养平板(中间为病原菌菌斑)19.图4为本技术实施例提供的④菌与番茄青枯病菌病原菌融合效果；左图为青枯病菌病原菌平板，右图为④号菌与青枯病菌病原菌共培养平板。20.图5为本技术实施例提供的qk‑1菌制备的复合微生物肥料对番茄枯萎病的拮抗效果；左图为枯萎病病原菌平板，右图为复合微生物肥料涂布的枯萎病病原菌平板。21.图6为本技术实施例提供的商品菌制备的复合微生物肥料对番茄枯萎病的拮抗效果；左图为枯萎病病原菌平板，右图为复合微生物肥料涂布的枯萎病病原菌平板。22.图7为本技术实施例提供的ck组的番茄幼苗生长情况。23.图8为本技术实施例提供的致病组的番茄幼苗生长情况。24.图9为本技术实施例提供的处理组的番茄幼苗生长情况。具体实施方式25.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。26.1、蚯蚓粪细菌的分离培养27.从蚯蚓养殖床上取新鲜蚯蚓粪10g于250ml三角瓶中，加90ml灭菌水，在25℃、180rpm的振荡仪上振荡30min中，静置30min，取1ml上清液加入装有9ml的灭菌水的试管中，进行稀释106～108倍，每个递度取1ml放入灭菌后的培养皿中，再将加热溶解冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒入平板中，摇匀培养基，放置完全凝固，再放入25℃恒温培养箱中培养，每个递度做5个平板培养48小时后，将平板中形态各异的菌挑出来，进行划线纯化培养2～3次，形成纯化的单菌落，一共得到了4株(分别是①②③④)形态不一的单株菌，对这4株纯化后的单菌株再进行病原菌种抗病试验。28.2、番茄枯萎病病原菌平板拮抗试验29.病原菌来源：学名fusarium oxysporum f.sp.lycopersici snyder et hansen称番茄尖镰孢菌(简称为fol)，购自明舟生物，货号bmz099230。30.fol平板：将fol病原菌接种至pda平板上培养至菌斑达到5cm后，作为fol平板，待用；31.试验菌平板：将①、②、③和④菌分别在牛肉膏蛋白胨培养基上划线培养48小时，待菌斑长成形成①、②、③和④菌的4个试验菌平板，备用；32.试验方法：用0.8cm打孔器取fol平板约0.8cm的菌斑置于土豆培养基平板上，同时在该fol菌斑四个角分别放置①、②、③和④种试验菌4个0.8cm的菌斑，1周后测量病原菌直径，计算抑菌率。33.抑菌率(％)＝(空白菌斑直径－病原菌菌斑直径)/空白菌斑直径×100％。34.如图1、2所示，①号菌对番茄枯萎病病原菌具有拮抗作用，而②号菌并未有拮抗作用。35.结果如表1所示，①号菌和④号菌对番茄枯萎病病原菌具有拮抗作用，抑菌率分别为77.42％和72.76％。表1中，“－”表示试验菌与ps菌株融合，无法测量其抑菌圈直径和抑菌率。36.表1[0037][0038]3、番茄青枯病拮抗试验[0039]由于经过上述实施例发现，仅有①号菌和④号菌对番茄枯萎病病原菌具有拮抗作用，因此，本技术进一步采用对番茄枯萎病病原菌有拮抗作用的①和④菌株进行番茄青枯病病原菌拮抗试验。[0040]番茄青枯病病原菌为青枯假单胞菌，学名：pseudo‑monas sollamacearum(smith)smith，简称为ps，购自明舟生物，货号b82437。[0041]ps平板：将ps病原菌接种至牛肉膏蛋白胨固体平板上培养至菌斑达到1cm后，待用；[0042]试验菌平板：将①、④菌分别在牛肉膏蛋白胨培养基上划线培养48h，待菌斑达到1cm后备用；[0043]试验方法：试验分为对照组和处理组，对照组试验菌平板上仅接种ps菌斑；处理组中，在1个试验菌平板上放置1个ps菌斑，四周接种4个①菌斑或④菌斑。具体方法为用0.8cm打孔器分别取ps菌斑、①菌菌斑和④菌菌斑，分别在每1个牛肉膏蛋白胨平板的中间放1个ps菌斑，并且在每1个ps菌斑四个角放4个①号菌试验菌平板或4个④菌试验菌斑，接种后放入25℃恒温培养箱培养观察7天分别测量ps菌斑直径，参照上述实施例的公式计算抑菌率，每个处理5个平板。[0044]表2[0045][0046]如图3‑4、表2可知，仅有①菌对番茄青枯病菌病原菌具有抑制作用，④菌完全没有抑制作用，与病原菌融合。表2中，“－”表示试验菌与ps菌株融合，无法测量其抑菌圈直径和抑菌率。[0047]4、①菌菌种鉴定[0048]因此，对①菌进行了16srdna序列分析和鉴定。[0049]采用硅基质吸附柱法从菌体样本中抽提dna，采用2×taq master mix(赛默飞)对所提取的dna进行pcr扩增，pcr扩增体系为2×taq master mix 25μl，bac_16s_27f(如seq id no.1所示)10μm 1μl，bac_16s_1492r(如seq id no.2所示)10μm 1μl，1μl gdna，添加ddh2o至50μl，对扩增产物进行一代测序(双向测序)；扩增条件为:94℃5min，95℃15s，50℃20s，72℃40s，40个循环；并由上海元莘生物医药科技有限公司进行测序分析。测序结果提交ncbi网站的genbank，登录blast程序比对，并用mega6.0软件构建菌株系统发育树，nj算法，自展次数设定为1000；结合《常见细菌鉴定手册》鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽抱杆菌(bacillus subtilis)qk‑1，其16srdna序列如seq id no.3所示。[0050]5、qk‑1定植蚯蚓粪发酵试验[0051]本试验分为对照组、处理1组和处理2组。[0052]对照组仅仅使用灭菌蚯蚓粪进行发酵。处理1组将商品化枯草芽孢杆菌(广州绿辉生物科技有限公司)接种至灭菌蚯蚓粪进行发酵。处理2组将上述筛选得到的qk‑1接种至灭菌蚯蚓粪进行发酵。[0053]qk‑1菌菌种制备方法：将固体培养的菌株转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中液体培养48小时，转速5000rpm离心5min，倒去上清液，将离心出来的菌液收集备用，同时采用稀释平板法，测定菌液浓度。[0054]发酵过程：每个处理称取1kg蚯蚓粪放入1l的烧杯中，用纸封口，放入灭菌锅中121℃，30min灭菌，然后将蚯蚓粪从灭菌锅中取出。灭菌后的蚯蚓粪冷却至常温时，商品菌0.5g(加入的菌数为0.5亿/g)与占蚯蚓粪重量1％的腐殖酸(济南海瑞宝化工有限公司)搅拌均匀后加入到灭菌蚯蚓粪中作为处理1组，qk‑1菌0.78g(加入的菌数折算为0.5亿/g)加入占蚯蚓粪重量1％的腐殖酸中搅拌均匀后再加入到灭菌的蚯蚓粪中作为处理2组，用灭菌的蚯蚓粪作为对照组。将以上三个处理放培养箱中25℃培养48小时，对各处理风干样进行枯草芽孢杆菌数量检测，方法是稀释平板法。[0055]表3[0056][0057][0058]由表3可知，灭菌蚯蚓粪中的还存在在少量的菌种，没有达到完全无菌的状态，加入商业菌种和qk‑1菌种后，均可在蚯蚓粪中大量繁殖，但繁殖数量以从蚯蚓粪中筛选得到的枯草芽孢杆菌qk‑1的数量明显高于商品菌在蚯蚓粪中的繁殖数量，说明从蚯蚓粪中选出的枯草芽孢杆菌的定植效果要好于商品菌在蚯蚓粪中的繁殖效果，可以在蚯蚓粪中更好的形成优势菌种。[0059]6、复合微生物肥料平板对抗试验[0060]以此基础，本技术实施例还提供了一种番茄用复合微生物肥料，其由qk‑1制备而得。该复合微生物肥料，按重量计，包含浓度不低于0.2亿/g的qk‑1、不低于20wt％的有机质、不低于8wt％的n‑p2o5‑k2o、1～2wt％的中微量元素、2～5wt％的cao和1～2wt％的mgo。其中，“wt％”表示重量百分比。[0061]具体的，该复合微生物肥料的制备方法包括以下步骤：[0062]qk‑1进行液体培养，液体培养基的内容：[0063]液体培养所用培养基为用工业培养基：葡萄糖1wt％、豆粕粉2.5wt％、玉米粉0.8wt％、硫酸锰0.003wt％、硫酸镁0.5wt％、磷酸二氢钠0.052wt％和磷酸氢二钠0.233wt％，调节ph值为7，置于100l的发酵罐中，培养基的量为罐体积的60％，进行在线灭菌后，接种qk‑1菌种，接种量为液体培养基重量百分比为5wt％进行，发酵温度为37℃，通气量为1v/v.min，发酵过程控制ph值为7，以活菌计数法对发酵液取样检测，当发酵液中活菌数不低于7亿/ml时，芽孢率达90％即可停止发酵，收集发酵液，离心去除上清液，得到浓缩的菌液备用。[0064]腐殖酸和生物炭(弘之源净水材料有限公司)与上述的菌液混合均匀后，一起加入至蚯蚓粪中，继续培养48h，使菌种定植于蚯蚓粪中，得到蚯蚓粪的培养物；再向该培养物中添加氨基酸钙、氨基酸镁、磷肥和钾肥，混合均匀即可得到所述的番茄用复合微生物肥料。[0065]其中，腐殖酸和生物炭的加入量均为蚯蚓粪质量的1wt％；氨基酸钙(西安展迅生物科技有限公司)和氨基酸镁(西安展迅生物科技有限公司)的加入量均为蚯蚓粪重量的1wt％，磷肥(磷铵，山东启智化工新材料有限公司)的加入量为蚯蚓粪重量的3wt％，钾肥(硫酸钾，郑州中科化工产品有限公司)的加入量为蚯蚓粪重量的2wt％。[0066]为此，本技术实施例还利用上述复合微生物肥料进行了番茄枯萎病平板对抗试验，具体实验如下：[0067](1)试验分为对照组、处理1组和处理2组。实验分别制备了fol平板和试验平板。[0068](2)fol平板：用pda固体培养基将fol菌进行培养至菌斑达5cm以上备用。[0069](3)试验平板：将本技术实施例提供的qk‑1生产的复合微生物肥料与无菌水按1:10的比例进行恒温振荡温度25℃，时间30min，振荡结束后静置30min，取浸提液1ml混入至待凝胶pda固体培养基中，摇匀，凝胶，即可制得处理1组的试样平板。处理2组的试样平板参照上述方法进行，区别仅在于其中使用了商品菌按照上述方法制备得到的复合微生物肥料进行，以制得处理2的试样平板。而对照组，使用pda平板作用试验平板。[0070](4)由fol平板用打孔器制得直径0.8cm的菌斑，分别放置在处理1组、处理2组和对照组的试样平板上，继续对试样平板培养5天后，按照上述实施例的方法测定商品菌和qk‑1菌分别对病原菌fol的抑菌圈和抑菌率。[0071]表4[0072][0073]如图5、6及表4可知，用qk‑1菌制备的复合微生物肥料的效果比商品菌制备的复合微生物肥料的抑菌率要高，可以达到75％以上，比商品菌复合微生物肥料的抑菌率高出8.39％。由此说明，本技术实施例提供的由qk‑1菌制备的复合微生物肥料具有更加优异的抑制番茄枯萎病病原菌作用。[0074]7、番茄幼苗抗枯萎病试验[0075]为了让复合微生物肥料与病原菌一起与番茄苗发生作用，本实施例将复合微生物肥料按1:5的重量比例混入无菌水中进行有氧浸提30min后，过100目筛，经检测浸提液中的菌数0.4亿/g，以此作为实验用复合微生物肥料的处理的肥料。[0076]番茄幼苗：每个处理种植12盆，每盆种3株，每个处理各36株。[0077]实验分为对照组、致病组和处理组。对照组的番茄幼苗不施肥不接种致病菌fol。处理组番茄幼苗在接种fol致病菌同时进行复合微生物肥料施肥。致病菌的番茄幼苗仅仅接种fol致病菌未进行复合微生物肥料施肥。其中，复合微生物肥料为上述实施例制备得到。[0078]实验过程为：对照组的番茄幼苗直接定植。致病组和处理组的番茄幼苗从基质中拨出后放入浓度为106个/ml fol菌液中浸泡20min后再进行定植。番茄幼苗定植完成后，致病组和对照组分别浇清水每钵30ml，处理组加制备的肥料溶液，每钵施用30ml溶液。实验由5月24日开始，进行至6月23日结束，期间可进行了7次统计各组的番茄幼苗死亡株数，并统计死亡率。[0079]表5番茄苗期死亡率[0080][0081]如图7‑9以及表5可知，番茄幼苗定植自身有22.22％的死亡率，而接种fol进行致病后的致病组的番茄幼苗死亡率上升至55.56％。而若在处理组中，致病同时施用复合微生物肥料显著降低番茄死亡率至与对照组相当，由此说明本技术实施例提供的复合微生物肥料具有对抗fol对番茄致病致死的作用，有效降低番茄幼苗死亡率。[0082]表6[0083][0084]表6给出了对番茄苗期的发病情况进行分级的标准，以及进行分级计算的病情指数。由表6可知，致病组病情指数比肥料组1的病情指数高27.12％，说明施用复合微生物肥料可以减轻发病症状，减轻病害对番茄生长的影响。[0085]以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。