下面介绍几个具有挑战性的分离示例。

需要纯化的分子类型及其总体稳定性会影响所采用的精纯方法与下游工艺。某些蛋白不能耐受低 pH 值，例如，在 AC 步骤之后进行洗脱时或当 pH 值接近蛋白等电点时，可能会形成聚集体。另一个示例是在高 pH 值下蛋白可能发生脱酰胺化。这可能会限制层析填料的选择，此时选择合适的填料变得愈发重要。

由于 mAb 样分子日趋多样化（例如双特异性抗体及其他抗体衍生分子），去除产品相关的杂质成为一项主要挑战。

以 bsAb 为例，四链抗体表达可能导致 10 多种不同抗体副产品的产生，它们的结构非常相似，包含错配体/同源二聚体或半抗体，以及轻链单体和二聚体。其中只有一种是所需要的分子，其他都是不需要的。

用于捕获的蛋白 A 亲和层析步骤有一个缺点，即所有分子变体（包括错配体/同源二聚体或半抗体）将与分子的 FC 部分发生相互作用并结合。因此，在许多情况下，这些分析变体无法与目标分子分离。如果使用 MabSelect™ PrismA 这类填料，有可能在捕获步骤中通过 VH3 相互作用（对于部分 VH3 序列而言）实现一定的选择性。

另外，您可能需要尝试其他亲和填料用于捕获（例如蛋白 L），或使用新型重组亲和配基来解决该问题。例如，如果分子中包含一个 kappa 轻链，可以使用蛋白 L。但是，为了区分错配的 bsAb，只能有一个半抗体中可以包含这种轻链。

尽管在捕获步骤中可以采取一定的办法来去除产品相关杂质，但为了确保获得好的去除效果，精纯填料和工艺条件的选择仍然非常重要。有时采用 MM IEX 有助于解决这一挑战。

本文提供了更多关于双特异性抗体纯化的见解。

由于 Fab 具有非糖基化结构，它们可以在微生物细胞中产生，而不需要使用哺乳动物细胞。在大肠杆菌中产生 Fab 时，需要去除宿主细胞内毒素这种重要杂质。即便在捕获步骤中已去除了大部分的内毒素，要达到预期的内毒素去除水平，精纯过程仍然是必不可少的。例如，可以在下游使用 AIEX 填料或 MM 填料（例如 Capto™ adhere 填料）进行处理。请注意，使用能耐受高浓度 NaOH 的捕获填料（例如，如果产品具有 VH3 相互作用，可使用 MabSelect™ PrismA 填料）可以提高内毒素的清除效率。

本文提供了更多关于抗体片段纯化的见解。

通过在抗体上偶联有效载荷（一种剧毒化学物质），我们可以靶向处理特定细胞。在这种应用中，抗体的作用是减少有毒物质对非靶向细胞的作用，从而最大限度地减少副作用。这些细胞毒性药物（有效载荷）的靶向递送，使它们在肿瘤学研究中具有非常积极的作用。

下游纯化面临的一项重要挑战是去除未偶联抗体、游离的细胞毒性药物，以及获得符合质量标准的药物抗体比 (DAR)。此外，有效载荷的大小和疏水性还可能导致 ADC 聚集体的产生。

由于有效载荷较小，并且相应的选择性变化较小，采用传统的层析填料去除这些杂质充满了挑战性。大部分未偶联有效载荷通常采用超滤作用去除。而 HIC 可以在精纯中成功地去除剩余的有效载荷杂质。不过 MM 有待进一步探索。

由于分子具有较高的毒性，应特别注意整个过程要在封闭系统中完成。此时采用一次性系统可能会具有重要价值。

即使有专门的病毒灭活或清除工艺步骤（例如病毒过滤、pH 值处理或溶剂/去垢剂），也应该采用层析步骤来帮助进行病毒清除。

在纯化工作流程中，为了达到预期的病毒log降值，可能需要采取按正交方式组合的额外层析步骤，从而导致这一工艺流程可能最终包含 4 个步骤。为防止发生这种问题，您应选择能够同时获得高产品质量与病毒清除率的填料。

部分考虑因素：

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