siRNA 诱导的沉默的持续时间：您的问题已得到解答 |
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化学合成的短干扰 RNA (siRNA) 可用于在培养的哺乳动物细胞中诱导沉默。细胞摄取后，siRNA 的引导链被整合到 RNA 诱导的沉默复合体 (RISC) 中，该复合体可引导含互补序列的信使 RNA 降解。siRNA 广泛用作了解健康和患病细胞及动物中细胞通路的基因功能的工具，在治疗性基因沉默方面拥有巨大潜力。在此，我们回答了有关将 siRNA 转染至人细胞中引起的 RNAi 效应的持续性的问题。 最近，Applied Biosystems 推出了下一代 siRNA 产品 Ambion Silencer Select siRNA。这些 siRNA 使用可提高沉默效率和效力的新算法设计而成，并且通过锁核酸 (LNA) 进行了化学修饰以提高特异性并减少脱靶效应。Applied Biosystems 科学家研究了这些 siRNA 在两个细胞系中诱导的沉默的持续时间，并研究了 siRNA 浓度和重复转染对沉默持续时间的影响。 单次 siRNA 转染后沉默持续时间有多长？ 在使用强效和高效 siRNA（例如新的 Ambion Silencer Select siRNA）处理的易转染细胞中，可在 5-7 天内实现近似最大沉默。图 1 显示了来自代表性实验的数据。四种不同 Silencer Select 预设计 siRNA 以 5 nM 浓度转染到 HeLa 细胞中。在转染后第 2 天观察到最大敲低 (>85%)，在第 5-7 天敲低持续保持在 >80%。除了一个 siRNA 外，在第 10 天仍观察到显著敲低。应注意的是，HeLa 细胞属于易转染类别，在 0.15 µL/孔（96 孔规格）的低转染试剂浓度下可实现良好敲低情况（不影响细胞活力）。在 BJ 细胞中观察到相似的 siRNA 诱导沉默持续时间（图 2），但实现高效递送（0.3 µL/孔）所需的转染试剂浓度稍高一些。 图 1.单次 Silencer Select siRNA 转染后的沉默持续时间。使用四种不同 Ambion Silencer Select 预设计 siRNA 以 5 nm 浓度转染 HeLa 细胞（500 个细胞/孔）。按照指示使用 TaqMan 基因表达 Cells-to-CT™ 试剂盒在转染后第 1 至 10 天裂解细胞，并使用指定 TaqMan 基因表达检测试剂盒直接在细胞裂解物中进行实时 RT-PCR。相对于用 Ambion Silencer Select 阴性对照 #1 siRNA 转染的细胞的数据表示敲低数据。 是否可通过提高转染的 siRNA 浓度延长沉默时间？ 不可以，将 siRNA 浓度从 5 nM 提高至 50 nM 并不会改善或延长沉默（图 2）。据推测，在 5 nM 下高效 siRNA 发生高效转染后 RISC 会达到饱和；过量的 siRNA 可能会快速降解、隔离或从细胞中排出。此结果与一项既往研究一致，该研究报告了 Silencer Select siRNA 在高 (100 nM) 和低 (3 nM) 浓度下的有效沉默（>80% 敲低）[1]。作者还进一步表明，降低 siRNA 浓度会减少对基因表达的脱靶效应，从而提高敲低特异性。 图 2.两种不同 siRNA 浓度下的 RNAi 效应的持续时间。如图 1 所示，在 5 nm 或 50 nm siRNA 浓度下使用相同的 Ambion Silencer Select 预设计 siRNA 转染 BJ 细胞（500 个细胞/孔）。按照图 1 所示测量敲低情况。 是否可通过重复 siRNA 转染实现长时间沉默？ 在某些情况下重复转染可延长沉默持续时间，但是我们发现该方法会带来不同的结果。图 3 显示，对于在 HeLa 细胞中检测的 4 种 siRNA 中的 3 种，与单次转染相比，在第 4 天添加第二次 siRNA 转染改善了第 6-11 天的敲低，尽管 4 种 siRNA 中只有一种实现 >70% 的敲低持续至第 14 天。在第一次转染后 24 小时进行第二次转染时，未发现 RNAi 效应的寿命显著延长（未显示数据）。结果表明，重复进行 siRNA 转染会改善第 6 天及之后某些 siRNA 的敲低，但敲低水平可能仅在极少数情况下达到第 2 天观察到的最高水平。 图 3.单次转染和双重转染后沉默的持续时间。使用四种独立 Ambion Silencer Select 预设计 siRNA (5 nM) 转染 BJ 细胞（500 个细胞/孔）。单次转染在第 0 天进行；双重转染在第 0 和 4 天进行（用箭头表示）。按照图 1 所示测量敲低情况。 结论 在我们的实验中，单次转染 5 nM Silencer Select siRNA 实现了 >80% 的敲低，在转染后持续了 5–7 天，然后逐渐降低。较高的 siRNA 浓度未产生更强或更持久的敲低，但可能会引起脱靶效应。在某些情况下，重复 siRNA 转染改善了转染后选定时间点的敲低。科学参与人员：Mu Li, Angie Cheng, Alexander (Sasha) Vlassov, Susan Magdaleno • Applied Biosystems Inc., Austin, TX |
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