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第 11-12 讲 基因功能研究技术 文章目录 8. 基因功能研究技术8.1 基因活性的操控技术8.1.1 过表达 (overexpression)8.1.2 基因定点突变 (site-directed mutagenessis) 技术8.1.3 RNAi 技术8.1.4 基因敲除 (gene knock-out) 技术 8.2 基因表达检测技术8.2.1 第一代测序技术 Sanger dideoxy sequencing8.2.2 第二代测序技术8.2.2.1 Roche / 454 : Genome Sequencer FLX8.2.2.2 lllumina Solexa cyclical base addition8.2.2.3 ABI SOLiD sequencing by ligation （用得不多） 8.2.3 第三代测序：单分子测序技术 8.3 功能调控与检测技术（没讲）8.3.1 表达量8.3.2 酵母单杂、双杂交系统8.3.3 各类相互作用技术8.3.4 标记和荧光成像技术 8. 基因功能研究技术
可以过表达、全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因过表达或者缺失后生物体的表型变化研究基因功能。 8.1.1 过表达 (overexpression) 重组 DNA 技术 (Recombinant DNA technology)：显性阴性蛋白蛋白质在细胞内往往是与其他蛋白质分步装配形成复合物，一起发挥作用。如果只是过表达其中一个蛋白，可能只是影响复合物的装配，而不影响复合物功能；但如果过表达蛋白质的突变体（利用重组 DNA 技术，Recombinant DNA technology ），很可能影响整个复合物的功能。
8.1.2 基因定点突变 (site-directed mutagenessis) 技术
基因定点突变 (site-directed mutagenessis, in vitro)：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造 DNA 调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
聚合酶链反应 (PCR) 的应用 (1) 亚克隆 (Subcloning DNA targets using PCR) T/A 克隆在引物中加限制性内切酶位点平端连接 (Blunt-end Ligation)◆ 使用 PCR 亚克隆 DNA 靶标 (2) 产生 DNA 探针 （两种方法） 直接合成（试剂公司）通过 PCR 产生单链 DNA 探针：控制上下游引物的比例，原理类似 TAIL-PCR。 PCR 产生用于体外转录的模板：在不配对区设计引物，在引物中加入 T7 promoter 序列（即测序引物），使 PCR 产物含有 T7 promoter，可以用来转录得到 RNA。 
(3) PCR 的诊断应用 使用基因组特异性引物对检测病原体筛选未知突变的特定基因使用已知的 STS 标记进行基因分型PCR 介导的定点突变 (重叠延伸法) PCR-mediated in vitro mutagenesis
多位点突变反应 (MMR) 策略
● 重叠延伸介导的定点诱变机制 首先将模板 DNA 分别与引物对 1（正向诱变引物 FM 和反向引物 R2) 和引物对 2（正向引物 F2 和反向诱变引物 RM) 退火，通过 PCR1 和 PCR2 扩增出两种靶基因片段。FMR2 和 RMF2 片段在重叠区发生退火，用 DNA 聚合酶补平缺口，形成全长双链 DNA, 进行 PCR3 扩增。最后，用引物 F2 和 R2 扩增出带有突变位点的全长 DNA 片段 (PCR4)。● 大引物诱变法 首先用正向突变引物 (M) 和反向引物 (R1), 扩增模板 DNA 产生双链大引物 (PCR1), 与野生型 DNA 分子混合后退火并使之复性。第二轮 PCR2 中加入正向引物 (F2), 与 PCR1 中产生的一条互补链配对，扩增产生带有突变的双链 DNA。由于 P2 的退火温度显著高于第一轮 PCR 所使用的引物 M 和 R1, 因此，可以忽略引物 M 和 R1 在本轮反应中所造成的干扰。获得定点突变 PCR 产物以后，一般需进行 DNA 序列分析以验证突变位点。● 参考文献：改进的多片段重叠延伸 PCR 制作基因多位点突变 采用重叠延伸 PCR（overlap extension PCR，OE-PCR） 法：第一轮 PCR 扩增出三个片段，第二轮 PCR 同时利用三片段重叠延伸产物作为模板扩增出目标基因突变体，再按常规分子克隆方法将其连入质粒载体。 PCR 介导的缺失突变
The Polymerase Incomplete Primer Extension (PIPE) 聚合酶不完全引物延伸 参考文献：The Polymerase Incomplete Primer Extension (PIPE) method applied to high-throughput cloning and site-directed mutagenesis [PMID: 18988020] 使用 PIPE 方法，所有主要的克隆操作均通过在扩增后立即用 PCR 产物转化感受态细胞来实现。普通的 PCR 会产生不完全延伸产物的混合物。使用简单的引物设计规则和 PCR，在这些不完全延伸混合物的末端引入短的重叠序列，使互补链退火产生杂交的载体/插入序列杂交体。这些杂交体在没有任何 PCR 后的酶促操作的情况下直接转化为受体细胞。 利用 PIPE 进行克隆，在载体中插入一个外源基因（A.B）/ 突变 (C.) PIPE 方法中使用的（A.B.C）三种常见 PCR 扩增的寡核苷酸设计，每个引物 5 '末端的前 15 个碱基被设计成互补序列。 A. V-PIPE (vector PCR)：引物 1 和 2 可用于扩增载体，例如 SpeedET。 B. I-PIPE（插入 PCR)：引物 3 和 4 可以用于扩增来自不同模板的插入片段（目的片段）。 P1 与 P3 ，P2 与 P4 的 5’端有 15 个碱基的反向互补序列（overlap），因此目的片段可以与载体重组相连 。 C. M-PIPE（突变 PCR)：引物 5 和 6 可用于产生点突变。引物 7 和 8 可用于构建缺失突变体。引物 9 和引物 10 可用于构建插入突变体。 参考文献：基于 PIPE 现象的质粒克隆位点序列设计与功能评价 8.1.3 RNAi 技术 RNAi (RNA interference, RNA 干扰）技术：利用双链 miRNA 高效、特异性降解细胞内同源 mRNA 从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi 的命名来源于安德鲁·法尔。
双链 miRNA 是 RNAi 的触发物，引发与之互补的单链 RNA (ssRNA, single-stranded RNA）的降解。细胞核中 DNA 转录出 pre-miRNA，加工后形成带 loop 环的双链 miRNA 进入细胞质。 经过 Dicer酶（一种具有 RNAaseⅢ 活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链 RNA (30 个核苷酸以上）首先被降解（切掉 loop 环）形成 21～25 个核苷酸的小分子干扰核糖核酸 (siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目标 mRNA。siRNA 是导致基因沉默和序列特异性 RNA 降解的重要中间媒介。 较短的双链 RNA 不能被有效地加工为 siRNA, 因而不能介导 RNAi。 siRNA 具有特殊的结构特征，即 5’-Pi 和 3’-OH，其两条链的 3’端各有两个碱基突出于末端。由 siRNA 中的反义链指导合成一种被称为 RNA 诱导的沉默复合体 (RISC) 的核蛋白体，再由 RISC 介导切割目的 mRNA 分子中与 siRNA 反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。 siRNA 还可作为特殊引物，在依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶的作用下，以目的 mRNA 为模板合成 dsRNA, 后者又可被降解为新的 siRNA, 重新进人上述循环。因此，即使外源 siRNA 的注入量较低，该信号也可能迅速被放大，导致全面的基因沉默。 在哺乳动物细胞内，较长的 dsRNA 会导致非特异性基因沉默，只有 21~25 个核苷酸的 siRNA 才能有效地引发特异性基因沉默 。 非哺乳动物细胞可以利用较长的双链 RNA 直接诱导产生 RNAi 而无须合成 siRNA, 因此，设计非哺乳动物细胞 RNAi 实验的步骤比较简便，只要通过目的基因体外转录得到所需要的 dsRNA, 再通过浸泡，注射或转染靶细胞即可实现 RNAi。 8.1.4 基因敲除 (gene knock-out) 技术 经典遗传学 (Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。现代遗传学 (Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测或者观察表现型，进而推导出该基因的功能。基因敲除 (gene knock-out) 又称基因打靶，通过外源 DNA 与染色体 DNA 之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体 DNA 可与目的片段共同稳定遗传等特点。基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物个体中的靶基因活性。 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。 (1) 完全基因敲除实验
 ◆ 目标序列的关键外显子中插入 neor 基因，两侧为 HSV-tk； ◆ 在 ES 细胞中发生同源重组后，neor 基因插入基因组中，而 HSV-tk 基因被剪切掉； ◆ 发生重组的 ES 细胞由于有 neor 基因而获得对新霉素 G148 抗性。因为缺失了 HSV-tk 基因，转化细胞同时具有嘌呤类似物丙氧鸟苷抗性。
高等动物基因敲除技术 真核生物基因敲除的技术路线：构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组 DNA 导入胚胎干细胞纯系中，使外源 DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的 DNA 序列整合到内源基因组中并得以表达。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。胚胎干细胞（ES 细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用
 (a) 利用 neo 基因替换目的基因外显子Ⅳ至外显子Ⅵ区段，得到 IAP 基因敲除的 ES 细胞。P. 内源 Southern 印迹探针。(b) Southerm 印迹实验 （DNA 水平），AP 基因已从基因组中敲除。 ◆ D3, 来自于亲本 ES 细胞的 DNA; ◆ # 48, IAP 基因敲除的 ES 细胞 DNA; ◆ +/+、+/-和-/-分别代表野生型、杂合体和纯合体。(c ) Northem 印迹实验 （RNA 水平），纯合小鼠体内 IAP 基因不表达。(d) Western 印迹实验 （蛋白质水平）。纯合小鼠体内检测不到 IAP 蛋白。TNAP, 非组织特异性碱性磷酸酶。(e) 在高脂饲养条件下，IAP 基因敲除的小鼠 ( ko) 较野生型小鼠 ( wr) 更易发胖。
(2) 条件型基因敲除 噬菌体的 Cre/LoxP 系统、Gin/Gix 系统、酵母细胞的 FLP/FRT 系统和 R/RS 系统是现阶段常用的四种条件型定位重组系统，尤以 Cre/LoxP 系统应用最为广泛。Cre/LoxP 系统 Cre 是来自大肠杆菌噬菌体 P1 中的一种特异重组酶，能识别 34bp 的 loxP 序列（序列短，容易插入基因组），并介导两个 loxP 位点之间的基因序列被删除或重组。 loxP 序列：来源于 P1 噬菌体，是由两个 13bp 反向重复序列和中间间隔的 8bp 序列共同组成，8bp 核心序列同时也确定 LoxP 的方向。Cre 在催化 DNA 链交换过程中与 DNA 共价结合，13bp 的反向重复序列是 Cre 酶的结合域。其序列如下： 5’ - ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT - 3’ 3’ - TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA - 5’ Cre 重组酶介导两个 LoxP 位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况： 条件型基因敲除策略
肝组织特异性表达 Cre-Lox 系统条件型敲除小鼠 40S 核糖体蛋白 S6 基因导致肝细胞分裂增殖受阻 ● Conditional KO mice: inducible cre-lox recombination Cre 重组酶融合至突变体雌激素配体结合结构域，其需要存在雌激素拮抗剂他莫昔芬用于激活重组酶 (CreERT2）。 ● 细胞特异性 Tet-ON （四环素诱导的表达系统） TetO（四环素响应启动子/操纵子）在用四环素类似物强力霉素（DOX）激活反向四环素反式激活因子 (rtTA）后驱动 cre 重组酶的表达。 基因捕获法原理 除了基因敲除法，还有人用基因捕获的方法通过随机插入突变破坏靶基因表达。基因捕获载体包括一个无启动子的报告基因（通常为 neor 基因）, 当该基因插入到 ES 细胞染色体某个部位，利用所在位点的转录调控元件得到表达时，该 ES 细胞就获得在含 G418 的选择性培养基上生长的能力。可通过分析标记基因侧翼 cDNA 或染色体 DNA 序列来获得靶基因的相关信息。
植物基因敲除技术 T-DNA 插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌 T-DNA 介导转化，将带有报告基因的 DNA 序列整合到基因组 DNA 上，如果这段 DNA 插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。由于该基因内部或附近插入了一段已知序列的 DNA, 可据此设计引物，用 PCR 方法将被破坏的靶基因序列分离出来。植物基因敲除及突变体筛选 若将靶基因（假定编码区为 900 bp) 两端的引物 LP、RP 及插入载体上的引物 LB 加入同一反应体系中进行 PCR, 理论上能得到三种类型的条带： ◆ 野生型植株中，只有 LP 和 RP 引物配对扩增出来的靶基因条带； ◆ 纯合型基因敲除植株，只有靶基因一端的引物可以与 LB 引物配对完成 PCR 扩增； ◆ 杂合型基因敲除植株，PCR 扩增后会同时出现两种条带。
基因的定点整合技术 （一） TALEN 介导的基因组定点修饰技术 TALEN: transcription activator-like effector nucleases 类转录激活因子效应物核酸酶，是一类人工核酸内切酶。由特异性的TALE DNA 结合结构域和非特异性FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。人工构建的序列特异性核酸内切酶能识别并切割特定的 DNA 靶序列，造成双链断裂，从而引起基因组结构的定点改变。参考资料★★★：TALEN 介导的基因组定点修饰技术 .ppt● TALE 识别模块 ● TALEN 介导的基因组定点修饰流程 ● TALEN 靶位点的挑选原则： TALEN 靶位点 5 端的前一位（第 0 位）碱基应为胸腺喀啶 (T)设计 TALEN 靶点网站：TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0（二） CRISPR/Cas 系统
CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑
CRISPR/Cas9 切割后修复： 1）基因敲除：在基因上产生 DSB ( 3bp upstream of the PAM site )，NHEJ 修复的过程中往往会产生 DNA 的插入或删除（indel)，造成移码突变，从而实现基因敲除。 2）特异突变引入：通过含有特异突变同源模板的同源重组 (homology directed repair，HDR) 来实现。DSB 会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。 3）定点转基因：通过含有转基因的同源模板的同源重组来实现。通过定点转基因的方法可以把基因插入到人的基因组 AAVS1 位点，这个位点是一个开放位点，支持转基因长期稳定的表达，破坏这个位点对细胞没有不良影响。 CRISPR/Cas9 系统已不仅仅是一种革命性的基因编辑工具，还能在各种原核和真核生物中调控基因转录。Cas9 的核酸酶发生双突变产生失活的 dCas9，即“dead Cas9"”，这种核酸酶失去切割 DNA 的功能，但在 gRNA 的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合 DNA。 参考文献： Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells 有别于绝大多数体细胞基因组，适应性免疫系统在淋巴细胞发育过程中可以进行高效编辑，对抗原受体进行高效突变，产生近乎无限的抗原受体库，用以抵御可能的病原体入侵。受这一机制的启发，研究小组发现诱导抗体高频突变的胞喀啶核苷脱氨酶（ activation-induced cytidine deaminase，AID）与失活的 dCas9 融合后，实现了功能变异的高通量筛选。在 sgRNAs 的引导下，dCas9-AID-P182X(AIDx) 可直接将胞密啶 C 或鸟嘌呤 G 转变为其它三种碱基，在预期位点产生一系列的变异。 参考资料： CRISPR/Cas 技术及其作用机制 CRISPR-dCas9 转录调控系统简介 单碱基编辑 Single base editing 参考文献： Programmable base editing of AT to G·in genomic DNA without DNA cleavage 不同于 CRISPR，碱基编辑不会切割双螺旋，而是使用酶将碱基转换为碱基而不改变其周围的碱基。利用 CRISPR-dCas9 定位到目标碱基处，dCas9 融合了一种特殊的酶（能对碱基发生修饰）
载体构建实例解析 详见：载体构建实例解析——构建 SETD3-pEGFP-N1 8.2 基因表达检测技术为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。 基因组序列的测定 基因组（genome）是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细胞内全部 DNA 分子的总和。 基因组学（genomics）是指研究并解析生物体整个基因组的所有遗传信息的学科。 ● 不同模式生物基因组的比较 鸟枪法序列测定技术
组装单个序列 1）将各个测序读数相互比较，并将它们重叠的位置组合以产生重叠群； 2）继续添加单个测序读数以构建更大和更少的重叠群； 3）最终，所有测序读数合并为每个染色体的单个共有序列 (大重叠群）。 基因表达通量检测技术转录组学研究 转录组 (transcriptome)，广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有 RNA 的总和，包括信使 RNA (mRNA)、核糖体 RNA (rRNA)、转运 RNA ( tRNA) 及非编码 RNA (non-coding RNA 或 siRNA)。现常指细胞中转录出来的所有 mRNA 的总和。基因组-转录组-蛋白质组（genome-transcriptome-proteome) 是中心法则在组学框架下的主要表现形式。通过特定生理条件下细胞内的 mRNA 丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。● 基于传统的 Sanger 测序法对转录组进行研究的方法主要包括： ① 表达序列标签 (expressed sequence tag, EST) 测序技术： 在遗传学中，表达序列标签或 EST 是 cDNA 序列的短子序列。用于 EST 产生的 cDNA 通常是来自 cDNA 文库的单个克隆。EST 测序数据是目前数量最多、涉及物种最广的转录组数据，但测序读长较短（每个转录物测定 400 ~ 500 bp)，测序通量小，测序成本较高，而且无法通过测序同时得到基因表达丰度的信息。ESTs 可用于鉴定基因转录物，并有助于基因发现和基因序列测定。EST 代表表达基因的部分序列。它们在数据库中可以表示为 cDNA /mRNA 序列或作为 mRNA 的反向互补物，即模板链。EST 包含足够的信息以允许设计用于 DNA 微阵列的精确探针，然后可用于确定基因表达。② 基因表达系列分析 (serial analysis of expression, SAGE) 技术。有人使用 SAGE 测序法，用不同转录物 3’端第一个 CATG 位点下游 14 bp 长的短标签序列来标识相应的转录物。由于标签序列较短，可以将多个标签串联测序，使 SAGE 法相对于 EST 测序在通量上大大提高。但过短的序列标签降低了序列的唯一性，即使用改进过的 LongSAGE(21 bp) 标签测序，仍然有一半的标签无法被准确注释到基因组上。 高通量测序技术 (high-throughput sexquencing) ，又名二代测序 (second-generation sequencing) 或深度测序 (deep sequencing), 可以一次性测定几十万甚至几百万条序列，是传统测序技术的一次革命，主要有 454 测序平台和 Solexa 测序平台。 基因表达水平检测 Northern 杂交：检测 RNA 表达水平表达序列标签（expressed sequence tag，EST）测序技术基因芯片技术 (DNA/RNA chip)数字表达谱 DGE (Digital Gene Expression)原位杂交技术 原位杂交 (In Situ Hybridization，ISH) 是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为 RNA 和染色体原位杂交两大类。RNA 原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的 mRNA 分子，两者杂交产生双链 RNA，可通过放射性标记或经殉促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。用 mRNA 的互补链为探针进行杂交。负对照，mRNA 的同义链，无杂交信号。荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 技术首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或 DNA 上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该 DNA 序列在染色体上的位置。FISH 技术不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高，若用经过不同修饰的核苷酸分子标记不同的 DNA 探针，还可能在同一张切片上观察几种 DNA 探针的定位，得到相应位置和排列顺序的综合信息。表达芯片/基因芯片 基因芯片（DNA chip），又称 DNA 微阵列 (DNA microarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。基因芯片可用于进行基因诊断。先建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图，用可疑病人的 cDNA 做探针与之杂交，确定哪些基因的表达受抑制或激活。数字表达谱 (Digital Gene Expression) 数字基因表达谱（Digital Gene Expression Profiling, DGE）利用新一代高通量测序技术和高性能计算分析技术，能够全面、经济、快速地检测某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况。
DNA 测序技术 ● 第一代测序技术 Sanger dideoxy sequencing ● 第二代测序技术 Roche 454 Pyrosequencinglllumina Solexa cyclical base additionABI SOLiD sequencing by ligation● 第三代测序技术 Single molecule sequencingHeliscope (cyclical base addition)Pacific Biosciences 8.2.1 第一代测序技术 Sanger dideoxy sequencing
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◆ 在引物中加入限制性内切酶酶切位点，PCR 扩增后酶切得到粘性末端，连接到载体中去。
完全基因敲除实验中一般采用取代型 (a) 或插入型 (b) 载体在 ES 细胞（胚胎干细胞 embryonic stem cell）中根据正-负筛选 ( positive-negative selection, PNS) 原理进行完全基因敲除实验。
◆ Cre-lox 重组的结果取决于侧翼 loxP 位点的方向和位置： ① 如果两个 LoxP 位点位于一条 DNA 链上，但方向相反，Cre 重组酶能导致两个 LoxP 位点间的序列 倒位； ② 如果两个 LoxP 位点分别位于两条不同的 DNA 链或染色体上（反式排列），Cre 酶能介导两条 DNA 链的交换或染色体易位。 ③ 如果两个 LoxP 位点位于一条 DNA 链上，且方向相同（顺式排列），Cre 重组酶能有效切除两个 LoxP 位点间的序列。
● 第一代测序技术的特点【本文地址】
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