免疫学技术实验原理

免疫组库测序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)）是以 T/B 淋巴细胞为研究目标，以多重PCR或5’RACE技术目的扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR区），再结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。  

用淋巴细胞分离液分离外周血T/B淋巴细胞，提取DNA（或RNA），采用多重PCR/5'RACE对CDR3进行捕获（5'RACE还可以测CDR1、CDR2），通过 Hiseq2000（Hiseq2500、Miseq）平台进行高通量测序。 DNA水平选择多重PCR方法，侧重研究基因重组信息；RNA 水平可选择多重PCR或5'RACE方法，侧重于研究基因的表达状态。  

                                                          表1. 多重PCR和5'RACE的比较

多重PCR

5’RACE

原理

与普通PCR相同

从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5’末端

扩增区域

CDR3

CDR

适用样品类型

DNA、RNA

RNA（需C区已知）

优点

不用打断，数据完整

可最大程度避免PCR扩增偏向性

缺点

PCR扩增偏向性

操作繁琐，实验打断会丢失部分序列，重复性不如多重PCR

免疫组库测序研究流程

免疫组库测序基本研究方法

免疫组库测序信息分析流程

下机数据采用比对软件比对并过滤测序背景，并与IMGT免疫细胞受体库的V\D\J基因比对，搜索相应的基因片段，为确保结果的高准确度，在完成初步比对后，将比对序列再次与数据库做重比对，以寻找精确的V\D\J基因片段和序列的位点，另外还统计分析VDJ基因频率，克隆频率分布，多肽序列数目等信息。

编辑： gaowei2010    来源：丁香园