叶色变异是植物比较常见的一种变异类型,多发生在苗期,表现为白化、黄化、浅绿、绿白、白翠、黄绿和条纹等。少数突变体会在植株生长到一定阶段后开始出现叶色变异如类病斑点、早衰[1]。有些突变体却表现出常绿的表型[2]。叶色表型变异可作为标记性状用于良种繁育和杂交制种的识别。此外,一些叶色突变体还伴有抽穗提前、抗旱性增强等性状,为遗传育种提供了优良资源。由于叶色变异涉及叶绿素合成降解、叶绿体发育及核质信号的互作等,因此,利用叶色突变体可比较完整地阐释植物光合系统的过程和原理。通过对光合系统结构、基因功能及调控机制的整体研究,有助于进一步揭示光合系统的工作机制,为实现“作物分子设计育种”提供理论依据[3]。迄今为止,在水稻上已经定位到超过130个叶色相关基因,至少有36个基因已经被克隆,包括6个白化转绿基因:V 1 [4, 5]、V 2 [6]、V 3 和St 1 [7]、YSA[8]、hw- 1 (t)[9]。V 1 编码1个定位在叶绿体的蛋白质NUS1,它参与叶绿体RNA的代谢调控过程,并促进叶片发育早期低温胁迫下质体遗传系统的建立,在NUS 1 缺失的突变体叶片发育早期,叶绿体rRNA积累减少,且低温下叶绿体的翻译和转录能力受到严重抑制[4, 5]。V 2 基因编码1个定位在质体和线粒体上的新型鸟苷酸激酶(GK),GK是鸟嘌呤代谢通路中的关键酶,在叶片发育和叶绿体发育早期行使功能,V 2 基因突变后抑制核基因组编码的质体蛋白的表达,影响到叶绿体分化,使叶绿体发育不能正常进行,导致叶片白化[6]。V 3和St 1 分别编码核糖核酸还原酶RNR的大亚基RNRL1和小亚基RNRS1,RNR调节DNA合成和修复过程中脱氧核糖核苷酸的形成速率,RNRL 1和RNRS 1 是叶绿素合成过程中叶绿DNA复制所必需[7]。YSA编码1个含有16个串联PPR基序的三角状五肽重复蛋白,其突变体3叶期之前为白化表型,之后逐渐转绿,至6叶期逐渐恢复至正常表型,且叶色变化与叶绿体含量呈正相关[8]。hw- 1 (t)编码含线粒体交替氧化酶AOX结构的叶绿体蛋白,参与叶绿体呼吸电子传递链,调控类胡萝卜素生物合成途经及其次生代谢途径[9]。

本实验室利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种‘南京11’,得到1个白化转淡绿的叶色突变体WGL。本研究对WGL进行生理生化分析、遗传分析、基因定位以及叶绿素合成、质体发育相关基因的表达分析等,以期为该基因的克隆及对叶绿素合成及叶绿体发育过程的功能研究提供参考。

WGL是由化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理籼稻‘南京11’获得的,经多代自交,其白化转淡绿叶性状能稳定遗传。2013年,将WGL与野生型‘南京11’种植于南京农业大学土桥水稻实验基地,每个材料各4行40株,成熟期调查株高、穗长、单株有效分蘖数、千粒质量等农艺性状。2013年,在南京土桥水稻实验基地,将WGL分别与‘越光’和‘日本晴’配置杂交组合得到F1。同年,将F1种植于海南陵水县观察F1表型并获得F2种子。2014年,在土桥种植F2,对F2群体中正常叶色和白化叶色进行数据统计。

以WGL为母本,分别与‘越光’和‘日本晴’杂交,F1套袋自交,F2单株种植,调查F1、F2单株表型,进行遗传分析。

分别取3叶期(白转绿前)、抽穗期WGL和野生型材料的叶片,测定叶绿素含量,重复5次,取平均值。采用丙酮浸提的方法提取色素,取约30~200 mg叶片称量后剪碎,置于相应体积的80%丙酮中,室温避光放置24 h,中间混匀多次。5 000 r · min-1离心10 min,上清液用紫外可见分光光度计(Beckman DU800 USA)测定663、645和470 nm处的吸光值,参照Lichtenthaler[10]的方法,测定和计算叶片单位质量叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)和类胡萝卜素x(Chlx)的含量:Chla=12.21A663-2.81A645;Chlb=20.13A645-5.03A663,Chlx=(1 000A470-2.05Chla-114Chlb)/245,A代表吸光值(absorbance)。

对3叶期WGL(白转绿前)和野生型叶片组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量进行测定,方法参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行。

采用CTAB法提取各单株叶片总DNA用于基因定位。从WGL/Nipponbare衍生的F2群体中挑选具有WGL叶色表型的单株,采用极端隐性个体定位的方法进行基因定位。利用实验室已有的SSR标记与InDeL标记共170个,对F2群体中的10个隐性极端个体进行初步连锁分析。然后再扩大极端个体数量进行精细定位。精细定位引物序列见表 1。

使用RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司),提取WGL 3叶期白化叶片与成熟期叶片以及野生型叶片的RNA,用DU800分光光度计,检测RNA的浓度及质量,电泳检测RNA的完整性。取2 μg RNA作为模板,使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(宝生物工程有限公司),反转录合成第1链cDNA。

利用Real-time PCR对WGL及其野生型中质体发育与叶绿素合成相关基因HEMA(谷氨酰-tRNA还原酶)、HEML(谷氨酰-1-半醛转氨酶)、HEMB(胆色素原合酶)、HEMC(羟甲基后胆色素原合酶)、HEME(尿卟啉原脱羧酶)、URO-D(粪卟啉原氧化脱羧酶)、HEMF(粪卟啉原氧化脱羧酶)、CHLD(镁螯合酶D亚基)、CHLH(镁螯合酶H亚基)、CHLI(镁螯合酶I亚基)、CHLM(镁原卟啉Ⅸ甲基转移酶)、CRD(镁原卟啉Ⅸ单甲酯环化酶)、DVR(二乙烯还原酶)、POR(NADPH原叶绿素酸脂氧化还原酶)、CHLG(叶绿素合成酶),以及叶绿体发育相关基因PsaA(光系统Ⅰ叶绿素脱辅基蛋白)、PsbA(光系统Ⅱ醌结合蛋白)、RbcL(Rubisco酶大亚基)、叶绿体转录/翻译相关基因RpoA和RpoB(质体RNA聚合酶亚基)、RPOTP(核RNA聚合酶)、RCA(二磷酸核酮糖羧化酶活化酶)、ATPα(ATP合酶α亚基)、ATPβ(ATP合酶β亚基)、NADH 2 (NADH氧化还原酶2)、NADH 4 (NADH氧化还原酶4)等26个相关基因的转录水平进行了测定[5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19]。Real-time PCR表达分析配制好反应体系,扩增反应在7900HT Real-Time PCR仪(Applied Biosystems)进行。反应体系为:1.8 μL cDNA模板,10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×),0.8 μL PCR Forward Primer(10 μmol · L-1),0.8 μL PCR Reverse Primer(10 μmol · L-1),6.8 μL ddH2O。反应程序为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环;待扩增反应结束后,使用7900HT Real-Time PCR仪自带的软件分析CT值,用OsActin基因的表达量作为内参,计算出目的基因的相对表达量。定量引物序列见表 2。

与野生型相比,大田环境下刚出苗的突变体WGL叶片表现白化,2叶1心期叶片开始转绿,但叶片边缘和叶尖仍表现白化。4叶期后,WGL叶色表现为淡绿色(图 1)。WGL的株高相对于野生型明显降低,剑叶长、剑叶宽、穗长、有效分蘖数、千粒质量等均有不同程度的降低,WGL全生育期比野生型长5 d左右(表 3)。

将WGL分别与粳稻品种‘越光’和‘日本晴’杂交,F1植株的株高和叶色均与表型正常亲本相似。根据叶片颜色,每个F2群体的单株均可划分为两类:一类表型正常,另一类与突变体相似,且分离比例符合3：1(表 4)。F2群体的白化植株均伴随株高降低性状,而叶色正常单株的株高正常,表明矮秆和白化转绿属共分离性状。上述结果表明WGL的突变表型受1对隐性核基因控制。

3叶期和抽穗期叶片中色素含量测定表明:WGL 3叶期单位质量叶片的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量显著低于野生型,抽穗期叶绿素a和类胡萝卜素的含量与野生型没有差异,但叶绿素b的含量仍显著低于野生型(表 5)。

与野生型相比,3叶期未转绿的WGL内抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性显著增加,过氧化氢酶(CAT)活性显著降低,脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量显著增加(表 6)。

采用WGL/Nipponbare F2群体为定位群体,选取在两亲本间有多态性的170个均匀分布于水稻12条染色体上的SSR和InDeL标记,采用极端隐性个体定位的方法,利用WGL/Nipponbare杂交F2群体10个极端进行初步连锁分析。结果在位于第3染色体短臂的InDeL ID3-9标记与SSR标记N3-17存在连锁现象,两者物理距离约为5.35 Mb(图 2-A)。而后扩大极端个体数量到392个,最终将目标基因定位在标记RM6472与N3-15之间,物理距离约680 kb(图 2-B)。此区间内共含有8个BAC(OSJNBa0009J13、OJ1345H02、OSJNBa0014O06、OSJNBa0021B21、OSJNAa0021B21、OSJNBb0085F02、OJ1193C08和OSJNBa0090D11)(图 2-C)。

WGL 3叶期前叶片表现出明显的白化表型,4叶期后叶片转为淡绿表型,且色素含量表现出异常,因此,其叶绿素合成基因与质体发育相关基因的转录可能受到一定程度的影响。利用实时荧光定量PCR对WGL及其野生型中叶绿素合成与质体发育相关的26个基因的转录水平进行了测定。结果表明:与野生型相比,突变体3叶期除叶绿素合成基因CHLI没有显著变化外,其余25个相关基因均显著下调;抽穗期叶绿素合成基因只有HEMA与HEMC显著下调,其他基因与野生型无显著差异,质体发育基因只有RpoA与RPOTP有下调,其余差异不显著。

叶片是植物最主要的光合作用器官,提高叶片光合效率对于提高稻谷产量具有重要意义[20]。叶色突变体是研究水稻叶绿素合成和分解代谢途径以及叶绿体功能的理想材料[21, 22]。

由谷氨酰-tRNA到叶绿素a和叶绿素b的整个生物合成过程共有15步反应,有15种酶参与其中,在拟南芥中已克隆了编码这15种酶的27个基因[23, 24, 25, 26, 27, 28]。在水稻中已克隆了参与叶绿素生物合成的9个基因,即第3染色体上编码Mg2+-螯合酶3个亚基的OsChlH、OsChlD和OsChl Ⅰ 基因[11, 12]以及编码联乙烯还原酶的OsDVR基因[13],第4染色体上编码原叶绿素酸酯氧化还原酶A的OsPORA基因[14],第5染色体上编码叶绿素合酶的YGL 1 基因[15],第10染色体上编码叶绿素酸酯a加氧酶的OsCAO 1和OsCAO2 基因[16, 17]以及编码原叶绿素酸酯氧化还原酶B的OsPORB基因[18]。与叶绿体发育相关的基因突变也可能会影响到叶绿素合成,产生变异的叶色表型。水稻白化转绿突变体V 2 因编码鸟苷酸激酶的基因突变,抑制叶绿体分化,在特定温度下叶片由于不含叶绿体而白化[6]。白化转绿突变体V 3和条斑叶转绿突变体st1分别由于编码核糖核苷酸还原酶大亚基(RNRL1)和小亚基(RNRS 1)的基因发生突变,核糖核苷酸还原酶活性显著下降,进而使与质体转录/翻译相关基因的表达下调,影响叶绿体的发育[7]。

本研究从水稻‘南京11’EMS诱变后代中发现了1个白化转淡绿突变体WGL,经多代鉴定,WGL叶色表型能够稳定遗传。与野生型相比,大田环境下刚出苗的WGL叶片表现为白化的表型,2叶1心期叶片开始转绿,但叶片边缘和叶尖仍表现白化。4叶期后的整个生育期,WGL叶色均变为淡绿色。WGL的株高相对于野生型明显降低,剑叶长、剑叶宽、穗长、有效分蘖、千粒质量等与野生型相比均有不同程度的降低。3叶期未转绿的WGL中叶绿素含量极低,抽穗期叶绿素b含量显著降低。

叶绿体是植物ROS(reactive oxygen species,ROS)形成的主要场所之一,白化叶片叶绿体发育受阻以及其他逆境胁迫,叶绿体中的电子传递链都将受到抑制,致使-O2、H2O2和超氧自由基大量形成,不能及时清除[29]。通过测定WGL抗氧化酶的活性,发现3叶期未转绿的WGL内SOD和POD活性显著升高,CAT活性显著降低,MDA含量显著升高,这些说明WGL 3叶期受到一定程度的氧化胁迫。选取隐性极端个体利用分子标记进行连锁分析,最终将基因WGL定位在第3染色体短臂的SSR标记RM6472和N3-15之间,物理距离约680 kb。

利用Gramene数据库(http://www.gramene.org/)和水稻基因表达数据库(http://ricexpro.dna.affre.go.jp/)对680 kb区间进行基因预测。在680 kb范围内共有96个基因,包括39个假定蛋白、47个有功能注释的基因和10个表达蛋白。在这96个基因中,只有3个基因已被克隆,即D 14、DL和OsMADS1。D 14 编码1个酯酶,抑制水稻分枝发生,负调节水稻分蘖数。DL基因控制水稻小花的心皮和叶片中脉的发育,该基因的异常导致叶片中脉和叶鞘发育不全,花也有不同程度的畸形。OsMADS 1 控制水稻花器官的发育,该基因发生的同源异形突变导致水稻产生叶状颖壳不育现象。因此在该区间内尚无报道过与控制WGL突变表型相似的基因,这说明WGL可能是1个新的基因。对WGL叶绿素合成基因与质体发育相关基因转录水平分析表明:与野生型相比,3叶期WGL叶绿素合成基因与质体发育相关基因均显著下调,而抽穗期仅有叶绿素合成基因HEMC和HEMA以及质体发育相关基因RpoA和RPOTP发生显著下调,其他基因无显著差异,这说明基因WGL可能参与调控叶绿素合成与质体发育。相比以往报道的水稻白化转绿突变体,WGL不仅有叶色表型,也有株高、有效分蘖数、千粒质量等产量性状的变化,说明基因WGL具有一因多效作用。基因WGL的挖掘有助于对叶绿素合成与质体发育分子机制的阐释。