——载体选质粒的原因：具有环状结构，能够携带目的基因

②利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制和转录/表达

质粒（最常用的载体）

一种能够自主复制，在细菌(或酵母菌)中独立于染色体之外存在的双链环状DNA分子

（4）其它载体：噬菌体、动植物病毒

(二)基因工程的基本操作程序

第一步：获取目的基因

目的基因：人们所需要的编码蛋白质的结构基因

方法

序列已知

①化学合成法 ——较长DNA单链合成过程中容易出现碱基缺失

如 反转录法（e.g获取mRNA逆转录成cDNA再用DNA聚合酶生成双链）

②聚合酶链式反应(PCR)扩增Polymerase Chain Reaction

（1）原料：水、缓冲液、4种游离脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶、模板DNA(……基因)、

对…基因特异的2段DNA引物（防止相互或自身折叠）

（2）过程：

第一步：加热至90～95℃，DNA在高温下变性解链

第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链（退火）

第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成能量来源于温度

(2)序列未知

建立基因文库：

建立一个包括目的基因在内的基因文库(保存在受体菌中)，再从基因文库中获取

3.目的基因大量扩增/分子水平的克隆

①利用受体细胞（如E.coli）无性繁殖，利用基因探针钓取，再导入最终受体细胞

e.g目的基因→大肠杆菌→农杆菌→植物细胞→植物

（主要在细菌分裂时几何级扩增，尽管质粒独立于拟核，可在分裂时发生自我复制，

但由于多数细菌对胞内质粒数量有限制，故该种复制对扩增效果不大）

②PCR技术

第二步：形成重组DNA分子（基因表达载体：启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因）

目的：转运目的基因，并使在受体内稳定存在、复制、表达/转录并稳定遗传（基因型X0）

过程：

（1）单酶切：用同种限制酶分别切割目的基因和载体从而形成相同的粘性末端， 然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来

——有时用不同限制酶也可以形成相同的粘性末端

（2）双酶切：用两种限制酶切割使目的基因和载体两端各形成两种粘性末端，防止载体和目的基因自身环化

第三步：将重组DNA分子导入受体细胞

——将目的基因整合到动植物细胞的染色体DNA上，原核生物不需要，噬菌体不一定整合

目的基因是否整合到染色体DNA上决定于基因表达载体上是否有相关序列（形成酶）

植物体细胞：农杆菌转化法（插入Ti质粒上的T-DNA），基因枪法、花粉管通道法

——导入叶绿体DNA中，由于细胞质/器DNA的遗传与性别相关联，故可避免因花粉传

播而造成基因污染（目的基因传播到非转基因生物中）

2. 动物受精卵：显微注射技术用（如显微注射）技术/方法将目的基因导入cf转基因/基因工程技术

3.原核细胞：CaCl2/Ca2+ 处理法（先用Ca2+处理增加细胞壁通透性，使之成为感受态细胞，

再将重组质粒与感受态细胞混合，在一定温度下感受态细胞吸收DNA分子）

——原核生物作为受体细胞的原因：

①繁殖快②体积小新陈代谢旺盛（目的产物合成效率高）③遗传物质少（便于操作）、

④单细胞（容易培养）

第四步：筛选含有目的基因的受体细胞

原因：受体细胞接纳重组DNA分子存在概率

原理：载体如质粒上的抗性基因等标记基因

方法：利用选择培养基筛选

①蔗糖转运蛋白：仅以蔗糖作为碳源的培养基

②菌落表现型：抗……不抗……

第五步：目的基因的检测和表达

——目的基因导入受体细胞可能仅进行大量扩增，但不一定以此为目的

DNA/核酸分子杂交技术

用cDNA作为探针与从受体细胞中提取并解旋的DNA/mRNA杂交，观察是否会出现杂交带

检测

①染色体DNA上是否插入了目的基因 ②目的基因是否转录出了mRNA

—— ①一种基因探针只能检测水体中的一种病毒；检测病毒可对照核酸序列

②放射性同位素标记探针

③基因探针是一小段cDNA，可以与相应基因转录出的mRNA结合（即使被切割）

采用DNA分子杂交技术/方法，用基因探针检测

2.抗原－抗体杂交：目的基因是否翻译成蛋白质 如E.coli合成人胰岛素原

个体水平的鉴定：如 转基因抗虫植物（让害虫吞食该转基因棉植株的叶片，观察害虫存活情况，以确定其是否具有抗虫形状）

——根本原因：联系基因层面，cf基因序列&碱基对/脱氧核苷酸序列

（三）基因工程的应用

1.动植物基因、细胞工程：优点①所需时间短②克服远缘杂交不亲和的缺陷（对应传统缺点）

2.基因工程药物：首次是生长素释放抑制激素，然后胰岛素（E.coli产酶原）、干扰素等

干扰素：我国第一个基因重组新药。一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。具有抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节等多种生物学功能，是治疗病毒性肝炎和肿瘤的药物。

干扰素是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。

基因治疗：将正常功能的外源基因导入缺陷细胞内（初级实验阶段、未临床实践）

——Cf有基因缺陷的染色体/DNA分子上：具体与哪条DNA分子结合随机

——治疗隐性遗传病（正常基因相对缺陷基因呈显性）

4.安全性问题：在导入目的基因的同时可能会导入其他基因如抗生素抗性基因，可能会使人体内细菌抗药性增强，以致某些药物的药效减弱

（四）蛋白质工程的概念

蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）返回搜狐，查看更多