整理归纳一下我所知道的基因型鉴定方法，欢迎补充！（封面图片来自网络，侵删，位置：华中农园林院正门入口附近）

随着基因工程技术——CRISPR Case9的推广，特定突变体的获得相比从前容易了很多，但位点上的突变依然是随机的，如何从多个转化事件中高效、经济、准确筛选出目的基因型依然是一个困难，这里我分享目前所知的鉴定方法供大家参考。

1.二代测序 + IGV观察/call SNP软件分析

原理：设计多种标签序列（F向和R向）组合，使不同的组合对应不同的样本，根据测序输出的reads上的标签序列对测序结果中的样本进行区分，一次测序获得多个样本数据，且测序数据量不用太高，1-2G即可，最后根据测序结果与参考序列匹配情况和reads比例判断突变类型和纯合杂合情况；

优点：通量高，单个样本成本低，能够分辨单个位点存在的多种突变类型；

缺点：结果反馈速度慢，一般需要两周左右才能拿到结果，不适合小样本量的检测。

2.一代测序 + DSDecodeM分析测序文件

原理：软件根据测序的信号峰双峰嵌套位置和强弱判断突变类型；

优点：速度快，一代测序结果一般第二天能得到，软件分析迅速；

缺点：单个样本成本高，不适合大样本量检测，位点存在两种以上的突变类型时，测序峰杂乱，手动和软件均不能很好的区分。

3.KASP

原理：用不同的荧光标记不同的引物（两种引物末端有1个SNP变异），PCR延伸后发出不同的荧光，根据荧光值判断基因型；

优点：检测速度快（扩增时间短），通量高（qPCR仪一次可96板）；

缺点：试剂成本高，仪器设备较贵，只适用于检测单位点SNP变异，不能清晰的知道序列变异情况，适用范围较窄。

4.dCAPs

原理：在已知序列变异的情况下，利用突变形成的酶切位点对突变位点的PCR扩增产物进行进行酶切检测，根据酶切结果判断突变情况。

优点：成本低（单个样本仅需0.1ul酶即可），通量大（可以同时对具有同类突变的大量样本进行检测），周期短（PCR扩增加酶切后电泳1天可完成）；

缺点：需要已知突变位点的序列情况才可选择合适的内切酶，有的内切酶可能不常见。

5.SSR分析

原理：根据条带大小的不同分析基因型；

优点：检测速度快，通量高，能够检测最低1bp的长度差异（推荐3bp以上）；

缺点：试剂成本较高（使用专业分析仪），只适合检测已知存在碱基缺失的突变位点。