Gateway 克隆实验流程 |
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Gateway 克隆反应的基础知识BP 反应—构建一个 Invitrogen Gateway 入门克隆LR 反应—构建一个 Gateway 表达克隆单管形式—从 PCR 产物构建一个 Gateway 表达克隆Gateway 载体转换—将你最爱的克隆载体转换成 Gateway 技术
TOPO TA 克隆—构建一个 Gateway 入门克隆
步骤 1—生成 PCR 产物 使用 Taq 聚合酶和你自己的实验流程生成 PCR 产物。以最后 7 到 30 分钟的延伸步骤结束 PCR 反应。 步骤 2—完成TOPO 克隆反应 按所示顺序使用试剂设置以下 Invitrogen TOPO 克隆反应。对于电穿孔法，将盐溶液稀释 4 倍以制备稀释盐溶液。试剂化学反应电穿孔新鲜的 PCR 产物0.5 至 4 µL0.5 至 4 µL盐溶液1 µL—稀释盐溶液—1 µL无菌水至最终体积 5 µL至最终体积 5 µLTOPO 载体1 µL1 µL总体积：6 µL6 µL轻轻混匀并室温孵育 5 分钟。置于冰上，继续进行下面的 Invitrogen One Shot 化学感受态大肠杆菌的转化步骤步骤 3—转化 One Shot 化学感受态大肠杆菌 对于每次转化，在冰上解冻一小瓶 One Shot 大肠杆菌细胞。将 2 µl TOPO 克隆反应液加到一小瓶 One Shot 化学感受态大肠杆菌中，并轻轻混合。在冰上孵育 5-30 分钟。42°C 热激细胞 30 秒，请勿震荡。立即将试管转移至冰上。加入 250 µl 室温 S.O.C.培养基。于 37°C 振荡孵育 1 小时。在预热的含有 100 µg/ml 壮观霉素的 LB 琼脂平板上涂布 10–50 µl 细菌培养物，并在 37°C 下孵育过夜。 Gateway 反应的基础知识BP 反应从含有attB 插入的 PCR 产物构建一个 Gateway 入口克隆是一个很简单的反应，仅需 1 小时。请参阅下面的设置概述。有关更多信息，请参阅手册。 在室温下将以下成分添加到 1.5 ml 试管中并混合： attB-PCR 产物（=10 ng/µl；最终量 ~15–150 ng）1–7 µl 供体载体（150 ng/µl）1 µl TE 缓冲液，pH 8.0 至 8 µl冰上融化 Invitrogen BP Clonase II 酶混合物约 2 分钟。将 BP Clonase II 酶短暂涡旋两次（每次 2 秒）。向每个样品（上述步骤 1）中加入 2 µl BP Clonase II 酶混合物，并通过短暂涡旋两次使其充分混合。简短地进行离心。将 BP Clonase II 酶混合物储存至 –20°C 或 –80°C。25°C 下孵育 1 小时。向每个样品中加入 1 µl 蛋白酶 K 溶液以终止反应。短暂涡旋。在 37°C 下孵育 10 分钟。转化 将1 µl的每个 BP 反应物转化进 50 µl Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1 噬菌体抗性细胞（货号 C8540-03）。冰上孵育 30 分钟。通过在 42°C 孵育 30 秒来热激细胞。加入 250 µl S.O.C.培养基，于 37°C 下振荡孵育 1 小时。分别将 20 µl 和 100 µl 的每次转化产物接种到选择性平板上。备注：可以使用任何转化效率 > 1.0×10 8 个转化子/μg 的感受态细胞。将 1 µl 的 pUC19 DNA（10 ng/ml）反应转化进上述50 µl Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1 噬菌体抗性细胞中。在含有 100 µg/ml 卡那霉素或供体载体适当选择标记物的 LB 板上分别接种 20 µl 和 100 µl。预期结果如果将整个 BP 反应转化并铺板，则有效的 BP 重组反应将产生 > 1500 个菌落。 LR 反应将您的基因从 Gateway 入门克隆转移到目标载体的过程是一个很简单的反应，仅需 1 个小时。请参阅下面的设置概述。有关更多信息，请参阅手册。 在室温下将以下成分添加到 1.5 ml 试管中并混合：入门克隆（50–150 ng）1–7 µl目标载体（150 ng/µl）1 µl TE 缓冲液，pH 8.0 至 8 µl冰上融化 Invitrogen LR Clonase II 酶混合物约 2 分钟。将 LR Clonase II 酶混合物短暂涡旋两次（每次 2 秒）。向每个样品（上述步骤 1）中加入 2 µl LR Clonase II 酶混合物，并通过短暂涡旋两次使其充分混合。简短地进行离心。将 LR Clonase II 酶混合物储存至 –20°C 或 –80°C 。25°C 下孵育 1 小时。向每个样品中加入 1 µl 蛋白酶 K 溶液以终止反应。短暂涡旋。在 37°C 条件下孵育 10 分钟。转化遵循 BP 反应实验流程，在LB 平板上使用针对目标载体的合适选择标记物（通常为100μg/ml 氨苄青霉素）。 预期结果 如果将整个 LR 反应转化并铺板，则有效的 LR 重组反应将产生 > 5000 个菌落。 单管形式如果您想将 attB 插入的 PCR 产物直接转移到表达克隆中，则可以使用以下实验流程轻松地将 BP 和 LR 反应合并。这将有可能消除 Gateway 入口克隆的转化和 DNA 分离。 在 1.5 ml 微量离心管中，准备以下 15 µl BP 反应：attB DNA（50-100 ng）1.0–5.0 µl attP DNA（Invitrogen pDONR 载体，150 ng/µl）1.3 µl BP Clonase II 酶混合物3.0 µl TE 缓冲液，pH 8.0 的最终体积为15 µl短暂涡旋混合均匀，然后在 25°C 下孵育 4 小时。备注：根据您的需要，重组反应的时间可以延长到 20 小时。过夜孵育所产生的菌落通常比 1 小时孵育结果多出 5 倍。对于大型质粒（=10 kb）和 PCR 产物（=5 kb），建议更长的孵育时间。将 5 µl 反应液移至另一个试管中，并使用该反应液评估 BP 反应的效率（请参见下文）。在剩余的 10 µl 反应中，添加：目标载体（150 ng/µl）2.0 µl LR Clonase II 酶混合物 3.0 µl 最终体积 15 µl短暂涡旋混合均匀，然后在 25°C 下孵育 2 小时。备注：根据您的需要，重组反应的时间可以延长到 18 小时。加入 2 µl 蛋白酶 K 溶液。在 37°C 下孵育 10 分钟。用 1 µl 反应液转化 50 µl 合适的感受态大肠杆菌。在含有合适抗生素的 LB 平板上进行平板培养以选择表达克隆。评估 BP 反应效率 在从“单管”实验流程的上述步骤 3 中获得的 5 µl 反应液中，加入 0.5 µl 蛋白酶 K 溶液。在 37°C 下孵育 10 分钟。用 1 µl 反应液转化 50 µl 合适的感受态大肠杆菌。在含有合适抗生素的 LB 平板上进行平板培养以选择入门克隆。 Gateway 载体转化将您最喜欢的克隆载体系列转换为 Gateway 技术是一个相当简单的过程，最终将使您简化克隆和表达过程。 若要将克隆载体转化成 Gateway 目标载体，过程如下： 根据需要选择合适的阅读框。使用合适的限制酶线性化您希望转化的载体。如果使用会产生粘性末端的限制酶，则需要补平这些粘性末端。使用小牛肠道碱性磷酸酶从载体中去除 5’ 磷酸。使用 T4 DNA 连接酶将阅读框连接到载体中。将连接反应转化进 One Shot ccdB Survival 感受态大肠杆菌，然后选择转化子。分析转化子。 相关资源 克隆工具和资源Gateway 载体选择工具 定制克隆服务分子克隆支持中心Gateway 开放式架构方针基因合成服务Gateway 引用和参考文献Katzen F (2007) Gateway recombinational cloning: a biological operating system.Expert Opin Drug Discov 4:571–589.相关产品Gateway 入门克隆和载体Gateway Clonase 重组酶 Gateway 目标载体供体载体Ultimate ORF 预制克隆手册Gateway 重组克隆手册Gateway 技术手册使用 Clonase II 的 Gateway 技术手册Gateway pENTR 载体手册Gateway pDONR 载体手册 |
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