本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种polg基因突变体及其应用。

背景技术：

polg相关综合征(polg-relateddisorders)是一系列临床表型重叠的疾病，大多数患者具有一部分给定的表型，但不一定是全部表型。polg相关综合征包括alpers-huttenlocher综合征、儿童肌急性肝病、肌阵挛性癫痫肌病感觉性共济失调、共济失调神经病变、常染色体显性/隐形遗传性进展性眼外肌麻痹等一系列综合征。国际早期的分子发病机制研究发现polg基因发生了突变。迄今为止，polg相关综合征的基因突变谱尚未完全发现，基因型和表现型的关系也不明确，因此迫切需要找到新的致病基因突变位点。

技术实现要素：

本发明通过全外显子组测序的方法确定了polg相关综合征的致病新基因。

根据本发明，提供一种polg相关综合征的生物标记物，所述生物标记物为突变的polg基因或polg蛋白，所述生物标记物是具有选自如下的突变的polg基因或polg蛋白：

在外显子17中错义突变(c.2617g>a；p.e873k)；

在外显子22中错义突变(c.3550g>a；p.d1184n)。

本发明提供一种分离的编码polg突变体的核酸，其中，所述核酸与seqidno:1相比，具有以下突变中的一种或两种：c.2617g>a突变、c.3550g>a突变。

本发明还提供一种分离的多肽，所述多肽为polg突变体，所述多肽与seqidno:2相比，具有以下突变中的一种或两种：p.e873k突变、p.d1184n突变。

其中，具有p.e873k突变的polg突变体是由具有c.2617g>a突变的polg突变基因编码，具有p.d1184n突变的polg突变体是由具有c.3550g>a突变的polg突变基因编码。

本发明还提供一种编码polg突变体的核酸在polg相关综合征检测中的用途，其中，通过检测所述核酸在采集自受试者的生物样品中是否存在来判断所述受试者是否易患polg相关综合征，其中，所述核酸与seqidno:1相比，具有以下突变中的一种或两种：c.2617g>a突变、c.3550g>a突变。

本发明还提供一种多肽在polg相关综合征检测中的用途，其中，通过检测所述多肽在采集自受试者的生物样品中是否表达来判断所述受试者是否易患polg相关综合征，其中，所述多肽为polg突变体，所述多肽与seqidno:2相比，具有以下突变中的一种或两种：p.e873k突变、p.d1184n突变。

其中，所述polg相关综合征为alpers-huttenlocher综合征、儿童肌急性肝病、肌阵挛性癫痫肌病感觉性共济失调、共济失调神经病变、常染色体显性/隐形遗传性进展性眼外肌麻痹中的一种或几种。

本发明还提供一种检测编码polg突变体的核酸的方法，其中，所述方法包括使用以下至少一组引物进行pcr扩增的步骤：

seqidno:3和seqidno:4；

seqidno:5和seqidno:6。

其中，引物seqidno:3和seqidno:4用于检测与seqidno:1相比具有c.2617g>a突变的核酸，引物seqidno:5和seqidno:6用于检测与seqidno:1相比具有c.3550g>a突变的核酸。

本发明还提供一种用于检测编码polg突变体的核酸的引物，其中，所述引物为以下中的至少一组：

seqidno:3和seqidno:4；

seqidno:5和seqidno:6，

其中，引物seqidno:3和seqidno:4用于检测与seqidno:1相比具有c.2617g>a突变的核酸，引物seqidno:5和seqidno:6用于检测与seqidno:1相比具有c.3550g>a突变的核酸。

本发明还提供一种用于筛选易患polg相关综合征的生物样品的试剂盒，其中，所述试剂盒含有特异性检测polg基因突变体的试剂，所述polg基因突变体与seqidno:1相比，具有以下突变中的一种或两种：c.2617g>a突变、c.3550g>a突变。

其中，所述polg相关综合征为alpers-huttenlocher综合征、儿童肌急性肝病、肌阵挛性癫痫肌病感觉性共济失调、共济失调神经病变、常染色体显性/隐形遗传性进展性眼外肌麻痹中的一种或几种。

本发明还提供一种检测polg相关综合征的方法，所述方法包括检测受试者的polg基因或polg蛋白中是否存在突变位点，如果有突变位点，则所述受试者被鉴定为患有polg相关综合征或易患polg相关综合征，所述突变位点选自如下任一种或其组合：

在外显子17中错义突变(c.2617g>a；p.e873k)；

在外显子22中错义突变(c.3550g>a；p.d1184n)。

其中，野生型polg基因具有seqidno:1所示序列，野生型polg蛋白具有seqidno:2所示序列。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。例如，突变(c.2617g>a；p.e873k)中，c表示cdna，p表示蛋白质，dna水平的突变对应蛋白质水平的突变；

野生型polg基因的cdna序列如seqidno:1所示。

野生型polg蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下至给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及polg基因的cdna序列，实际上包括该序列以及其互补序列。例如，提及seqidno:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

本申请中的基因序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及polg基因的cdna序列，实际也包括相应的rna序列。

实施例1确定polg相关综合征的致病基因

发明人在国内收集到1个核心家系中的1位患有polg相关综合征的病例，患者2011年3月11日出生，胎龄30周出生，早产，1640g，顺产。后通过新生儿筛查确诊为苯丙酮尿症，确诊血值为7.3mg/dl。其后一直按照低苯丙氨酸饮食治疗。血值基本控制在6mg/dl以下。期间复查听力，初筛、复筛均未通过。患儿6个月(矫正胎龄4个月)时因发热心率过快入院，常规检查发现谷氨酰丙氨酸氨基转移酶(alt值为179u/l)升高。患儿7个月及8个月时两次复查alt均为41u/l，9个月时复查alt升至80u/l，10个月时alt数值为74u/l。患儿7个月和10个月时查脑电图、心电图、头颅b超、mri及超声心动均未提示明显异常。11个月时查线粒体酶活性，发现线粒体复合物i和v缺陷，复合物i+iii偏低。因此临床认为是线粒体肝病。8个月时确诊听力问题，脑干诱发电位abr100db无反应。多频稳态听觉诱发反应(assr)发现双耳听力损伤均在中重度以上，因此初步确诊为听神经病。期间及其后亦发现患儿脚出现内旋，略有尖足显现，肌张力低下、发育迟缓、智力轻度落后、大运动极度落后(坐不稳、不能爬、不能站立、不会走)。后来亦发现患儿有外眼肌麻痹(externalophthalmoplegia)。患儿在6岁时死亡。根据以上检查结果提示患者为polg相关综合征。

发明人对先症者进行了全外显子组测序，具体步骤如下：

样品制备：采集所述患者及其父母家人外周血，利用试剂盒抽提外周血白细胞中的基因组dna(qiaampdnaminikit51304.qiagen,usa)，利用nanodrop2000测量dna的浓度及纯度(thermoscientific,usa)，所得的每个标本基因组dna的od260/od280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于100ng/μl，总量不少于30μl。

然后，对上述1个样本的外显子组序列进行了测序。测序平台为illuminahiseq2000，依照illumina标准建库说明书(参见http://www.illumina.com/)进行测序，简述如下：

1)使用illumina公司试剂盒truseqdnalibraryprepkit制作dna文库。在外显子捕获过程中使用agilent公司试剂盒sureselecthumanallexonv5；

2)使用illumina公司hiseq2000测序平台对捕获的外显子区域进行平行测序读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少为100；

3)使用burrows-wheeleraligner(http://bio-bwa.sourceforge.net/)将测序结果比对到人参考基因组中(hg19)。使用samtools将重复读取结果去除，通过gatk(https://www.broadinstitute.org/gatk/)进行调整和校准。然后使用samtools(http://www.samtools.sourceforge.net/)挖掘出snvs及indels，并用annovar(http://www.openbioinformatics.org/annovar/)命名。

将等位基因频率大于1％的突变位点剔除(参考数据库包括dbsnp，1000genomes，exomeaggregationconsortium(exac))。

发现先症者在基因polg上具有复杂杂合突变，这些位点可能是致病位点，结果显示于表1。

因此发明人认为polg基因极有可能为polg相关综合征的致病基因。

实施例2在其他病例中确认上述polg相关综合征的致病基因

发明人纳入polg相关综合征患者及其家属，对polg基因为polg相关综合征的致病基因进行验证。验证中利用sanger法测序验证polg基因的突变，其中考虑了家系内等样本验证情况。

分别对1名患者、2名家系内正常人(即其中1名患者的父母，他们均未发病)基因进行检测。

具体方法步骤如下：

1.dna提取：

分别提取1名患者、2名家系内正常人的外周静脉血，按照实施例1的方法提取基因组dna和测定dna含量。

2.引物设计及pcr反应

引物设计参考人类基因组序列数据库hg19，具体见下。

a)引物序列：

b)反应体系：

pcr扩增体系：

c)pcr反应条件：

94℃变性5分钟，然后进入每个循环，即94℃变性30秒，退火(通常为55℃，根据不同引物的退火温度设定)30秒，72℃延伸1分钟，总共设定30个循环。所有循环结束，最终72℃延伸10分钟，并将pcr产物保存在4或-20℃。

3)将步骤2中获得的获自1名polg相关综合征患者、2名家系内正常人(即该患者的父母，他们均未发病)的pcr扩增产物直接进行dna测序，方法同实施例1。

发明人收集到的家系内1例polg相关综合征病例在polg基因中检测到有意义的复杂杂合突变位点。同时所发现的突变位点在患者家属人中各只携带一个不同的突变等位基因，因此突变在家系内共分离。这些突变位点在exac数据库中的频率极低(见表1)，提示所检测到的位点很可能并非snp。因此我们认为polg基因为polg相关综合征的致病基因。

表1：

上述说明示出并描述了本发明的一种实例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附加权利要求的保护范围内。

以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是，这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释，并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下，可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰，这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

序列表

首都医科大学附属北京妇产医院

polg基因突变体及其应用

6

siposequencelisting1.0

1

3720

dna

homosapiens

1

atgagccgcctgctctggaggaaggtggccggcgccaccgtcgggccagggccggttcca60

gctccggggcgctgggtctccagctccgtccccgcgtccgaccccagcgacgggcagcgg120

cggcggcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcaacagcagcctcagcagccgcaa180

gtgctatcctcggagggcgggcagctgcggcacaacccattggacatccagatgctctcg240

agagggctgcacgagcaaatcttcgggcaaggaggggagatgcctggcgaggccgcggtg300

cgccgcagcgtcgagcacctgcagaagcacgggctctgggggcagccagccgtgcccttg360

cccgacgtggagctgcgcctgccgcccctctacggggacaacctggaccagcacttccgc420

ctcctggcccagaagcagagcctgccctacctggaggcggccaacttgctgttgcaggcc480

cagctgcccccgaagcccccggcttgggcctgggcggagggctggacccggtacggcccc540

gagggggaggccgtacccgtggccatccccgaggagcgggccctggtgttcgacgtggag600

gtctgcttggcagagggaacttgccccacattggcggtggccatatccccctcggcctgg660

tattcctggtgcagccagcggctggtggaagagcgttactcttggaccagccagctgtcg720

ccggctgacctcatccccctggaggtccctactggtgccagcagccccacccagagagac780

tggcaggagcagttagtggtggggcacaatgtttcctttgaccgagctcatatcagggag840

cagtacctgatccagggttcccgcatgcgtttcctggacaccatgagcatgcacatggcc900

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ccagtgactctggccggcatgctggagatgggtgtctcctacctgcctgtcaaccagaac1320

tgggagcgttacctggcagaggcacagggcacttatgaggagctccagcgggagatgaag1380

aagtcgttgatggatctggccaatgatgcctgccagctgctctcaggagagaggtacaaa1440

gaagacccctggctctgggacctggagtgggacctgcaagaatttaagcagaagaaagct1500

aagaaggtgaagaaggaaccagccacagccagcaagttgcccatcgagggggctggggcc1560

cctggtgatcccatggatcaggaagacctcggcccctgcagtgaggaggaggagtttcaa1620

caagatgtcatggcccgcgcctgcttgcagaagctgaaggggaccacagagctcctgccc1680

aagcggccccagcaccttcctggacaccctggatggtaccggaagctctgcccccggcta1740

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aaactcatggcacttacctgggatggcttccctctgcactactcagagcgtcatggctgg1860

ggctacttggtgcctgggcggcgggacaacctggccaagctgccgacaggtaccaccctg1920

gagtcagctggggtggtctgcccctacagagccatcgagtccctgtacaggaagcactgt1980

ctcgaacaggggaagcagcagctgatgccccaggaggccggcctggcggaggagttcctg2040

ctcactgacaatagtgccatatggcaaacggtagaagaactggattacttagaagtggag2100

gctgaggccaagatggagaacttgcgagctgcagtgccaggtcaacccctagctctgact2160

gcccgtggtggccccaaggacacccagcccagctatcaccatggcaatggaccttacaac2220

gacgtggacatccctggctgctggtttttcaagctgcctcacaaggatggtaatagctgt2280

aatgtgggaagcccctttgccaaggacttcctgcccaagatggaggatggcaccctgcag2340

gctggcccaggaggtgccagtgggccccgtgctctggaaatcaacaaaatgatttctttc2400

tggaggaacgcccataaacgtatcagctcccagatggtggtgtggctgcccaggtcagct2460

ctgccccgtgctgtgatcaggcaccccgactatgatgaggaaggcctctatggggccatc2520

ctgccccaagtggtgactgccggcaccatcactcgccgggctgtggagcccacatggctc2580

accgccagcaatgcccggcctgaccgagtaggcagtgagttgaaagccatggtgcaggcc2640

ccacctggctacacccttgtgggtgctgatgtggactcccaagagctgtggattgcagct2700

gtgcttggagacgcccactttgccggcatgcatggctgcacagcctttgggtggatgaca2760

ctgcagggcaggaagagcaggggcactgatctacacagtaagacagccactactgtgggc2820

atcagccgtgagcatgccaaaatcttcaactacggccgcatctatggtgctgggcagccc2880

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aaggcccagcagatgtacgctgccaccaagggcctccgctggtatcggctgtcggatgag3000

ggcgagtggctggtgagggagttgaacctcccagtggacaggactgagggtggctggatt3060

tccctgcaggatctgcgcaaggtccagagagaaactgcaaggaagtcacagtggaagaag3120

tgggaggtggttgctgaacgggcatggaaggggggcacagagtcagaaatgttcaataag3180

cttgagagcattgctacgtctgacataccacgtaccccggtgctgggctgctgcatcagc3240

cgagccctggagccctcggctgtccaggaagagtttatgaccagccgtgtgaattgggtg3300

gtacagagctctgctgttgactacttacacctcatgcttgtggccatgaagtggctgttt3360

gaagagtttgccatagatgggcgcttctgcatcagcatccatgacgaggttcgctacctg3420

gtgcgggaggaggaccgctaccgcgctgccctggccttgcagatcaccaacctcttgacc3480

aggtgcatgtttgcctacaagctgggtctgaatgacttgccccagtcagtcgcctttttc3540

agtgcagtcgatattgaccggtgcctcaggaaggaagtgaccatggattgtaaaacccct3600

tccaacccaactgggatggaaaggagatacgggattccccagggtgaagcgctggatatt3660

taccagataattgaactcaccaaaggctccttggaaaaacgaagccagcctggaccatag3720

2

1239

prt

homosapiens

2

metserargleuleutrparglysvalalaglyalathrvalglypro

151015

glyprovalproalaproglyargtrpvalserserservalproala

202530

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354045

glnglnglnglnglnglnglnproglnglnproglnvalleuserser

505560

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65707580

argglyleuhisgluglnilepheglyglnglyglyglumetprogly

859095

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100105110

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115120125

proleutyrglyaspasnleuaspglnhispheargleuleualagln

130135140

lysglnserleuprotyrleuglualaalaasnleuleuleuglnala

145150155160

glnleuproprolysproproalatrpalatrpalagluglytrpthr

165170175

argtyrglyprogluglyglualavalprovalalaileprogluglu

180185190

argalaleuvalpheaspvalgluvalcysleualagluglythrcys

195200205

prothrleualavalalaileserproseralatrptyrsertrpcys

210215220

serglnargleuvalglugluargtyrsertrpthrserglnleuser

225230235240

proalaaspleuileproleugluvalprothrglyalaserserpro

245250255

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260265270

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275280285

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290295300

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305310315320

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325330335

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340345350

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355360365

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370375380

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385390395400

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405410415

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420425430

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435440445

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450455460

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610615620

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675680685

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705710715720

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725730735

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740745750

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755760765

asppheleuprolysmetgluaspglythrleuglnalaglyprogly

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glyalaserglyproargalaleugluileasnlysmetileserphe

785790795800

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leuarglysvalglnarggluthralaarglysserglntrplyslys

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trpgluvalvalalagluargalatrplysglyglythrgluserglu

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leuglnilethrasnleuleuthrargcysmetphealatyrlysleu

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serasnprothrglymetgluargargtyrglyileproglnglyglu

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122012251230

lysargserglnproglypro

1235

3

25

dna

人工序列(artificialsequence)

3

agataggaccgtgtaggtgaggggt25

4

25

dna

人工序列(artificialsequence)

4

gacaagcaggagtgagaaaagcagc25

5

23

dna

人工序列(artificialsequence)

5

gaaaacagtgctggaccttcacc23

6

25

dna

人工序列(artificialsequence)

6

agcctgagtcaagagtggattctct25