【实验目的】

1.学习细菌涂片和染色的基本技术，掌握细菌的革兰氏染色方法。

2.初步认识细菌的形态特征。个体形态：镜检，群体形态：菌落特征。

3.学习显微镜(油镜)的使用方法和无菌操作技术。

4.了解培养基的配制原理、要求和注意事项；学习并掌握培养基的配制。

【实验原理】

培养基是指利用人工方法将合适微生物是指繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制的营养基质。主要用于微生物的分离、培养、鉴定、发酵和保藏。为了满足微生物生长繁殖或积累代谢产物，培养基一般应含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，还必须控制培养基的pH。一般细菌和放线菌等原核微生物适合生长在中性偏碱的环境，而酵母和霉菌则适合生长在中性偏酸的环境。因此，在配制培养基时，须将培养基调节在一定的pH范围内。

细菌的个体形态观察常用碱性染料进行简单染色，这是因为在水溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子带正电荷因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

革兰氏染色是广泛使用于细菌鉴别的一种染色法。其原理是通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色：而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度低，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经蕃红复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。因此革兰氏染色实质是分离鉴别细胞壁构造不同的两类细菌。

【实验步骤】

(一)  培养基配置：

1.玻璃器皿的洗涤：玻璃器皿在使用之前必须洗刷干净，用自来水冲洗。

2.培养基的配制：按培养基配方准确称量所需的各种营养物质。LB培养基配方：胰蛋白胨 0.8g、酵母提取物 0.4g、NaCl 0.4g、加蒸馏水至 80mL、琼脂：1.6g。固体培养基：2g 琼脂/100 mL培养基，半固体培养基：0.5g 琼脂/100 mL培养基。

3.培养基的灭菌：使用高压蒸汽灭菌对培养基进行灭菌，灭菌条件为121℃,15-20min。如果培养基中含糖，由于糖不耐高温，应降低灭菌温度并延长灭菌时间。

4.无菌操作倒平板：通常使用划线分离来进行微生物的纯种分离，此时需使用固体平板。将已灭菌的固体培养基融化至55℃左右，通过无菌操作将培养基倒入无菌平皿中。

(二)  细菌染色：

1.涂片：在载玻片上，滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作方法分别从平板上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。

2.干燥：室温自然干燥。

3.固定：涂面朝上，通过火焰2~3次固定涂片。

4.染色：滴加1-2滴染液于涂片上并保持1-2分钟。

5.水洗：倒去染液，用水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。

6.干燥：用吸水纸吸干即可。

7.镜检：涂片干燥后镜检。

(三)   革兰氏染色：

1.用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染(单染)。

2.用碘溶液进行媒染。

3.用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。

4.用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对涂片进行复染。

【实验结果】

对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌做革兰氏染色，然后在100x油镜下镜检：如下图所示。

手绘图：

金黄色葡萄球菌菌落：

大肠杆菌菌落：

金黄色葡萄球菌与大肠杆菌菌落对比：

【讨论】

1、制备细菌染色标本时应注意载玻片耍清洗干净保证洁净无油，取蒸馏水和取菌时不宜过多，涂片耍涂抹均匀，不宜过厚。固定时温度不宜过高(以玻片边缘不烫手为好)，否则会改变甚至破坏细胞形态。染色时染液刚好覆盖涂片薄膜为宜。水洗时不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大以免涂片菌膜脱落。最后细菌涂片必须完全干燥后才能用显微镜（油镜）观察。

2、如果涂片没有完全干燥就用显微镜（油镜）观察，有些色素溶解于香柏油会造成镜头污染，影响观察。水还会影响香柏油的透光率，油和水之间会分层，光会发生折射，造成放大倍数误差，不利于油镜观察。

3、细菌个体典型的形态特征有：

球菌：外形呈圆球形或椭圆形的细菌，直径0.5-1微米，有以下几种类型：

①单球菌：单独存在，如尿素小球菌。

②双球菌：如肺炎双球菌。

③链球菌：如乳酸链球菌。

④四联球菌：形成的4个细胞排列在一起，成田字，如四联球菌。

⑤八叠球菌：如尿素生孢八叠球菌；⑥葡萄球菌：如金黄色葡萄球菌。

杆菌：外形为杆状的细菌

常有长宽接近的短杆或球杆状菌，如甲烷短杆菌属。

长宽相差较大的棒杆状或长杆状菌，如枯草芽孢杆菌、梭状杆菌。

分枝状或叉状菌，如双歧杆菌属。

竹节状（两端平截），如炭疽芽孢杆菌。

按杆菌细胞的排列方式不同则有成对的双杆菌、呈链状的链杆菌，另外，常有栅状、“八”字状以及由鞘衣包裹在一起的丝状等多种。

典型的杆菌有大肠杆菌、枯草杆菌、链杆菌、变形杆菌。

螺旋菌：螺旋状的细菌，一般长5-50微米，宽0.5-5微米，根据菌体的弯曲可分为：

①弧菌：螺旋不足一环者呈香蕉状或逗点状，如霍乱弧菌。

②螺菌：满2-6环的小型、坚硬的螺旋状细菌，如小螺菌。

③螺旋体：旋转周数多（通常超过6环）、体长而柔软的螺旋状细菌，如梅毒螺旋体。