近日，中国药科大学的徐莉莉副研究员、狄斌教授、尤启冬教授团队利用靶标垂钓揭示了1,2,4-噁二唑类Nrf2-ARE激活剂的潜在靶标蛋白——26S蛋白酶体的Rpn6亚基。前期该团队的许多研究表明，基于表型筛选得到的1,2,4-噁二唑类 Nrf2-ARE 激活剂，对急性肺损伤、慢性结肠炎、帕金森等炎症相关疾病具有广泛的治疗作用，但此类分子的具体作用靶标蛋白仍未知，从而阻碍了此类分子的进一步成药性开发。在这些衍生物中，DDO-7263 是抗炎效果最理想的 Nrf2-ARE激活剂，因此作为生物活性探针的母核结构，被用于探索此类化合物的精确作用机制。

活性小分子探针是靶标识别的重要工具，在新药靶标发现和靶蛋白特异性识别中具有重要意义。该研究探针由三部分组成：与靶蛋白结合的活性基团、连接基团和生物素/荧光素标记基团。该团队基于DDO-7263，设计并合成其类似物，以及生物素标记和荧光素标记的探针，通过荧光素酶报告基因、ELISA、Western blot等实验验证该类似物以及标记探针在Nrf2-ARE通路上活性的保留，结果表明它们与 DDO-7263具有类似的生物学活性，包括激活Nrf2及其下游靶基因、抗氧化应激和抗炎作用。

图1. 生物素标记、荧光素标记DDO-7263探针结构

随后，基于亲和层析和质谱分析技术，该团队利用生物素探针结合亲和下拉技术，寻找与DDO-7263相互作用的特异性蛋白，经多次试验筛选出125种可能的目标蛋白。对这125种蛋白的基因本体分析表明，1,2,4-噁二唑类 Nrf2-ARE 激活剂的作用靶点与26S蛋白酶体的重要成分Rpn6蛋白密切相关。

26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11（PSMD11，又称Rpn6），是促进26S蛋白酶体组装的必需蛋白质之一，在19S调节颗粒（RP）和20S核心颗粒（CS）之间的关联中起着至关重要的作用。有研究表明，Rpn6是一个潜在的药物靶点，通过干扰26S蛋白酶体的组装来抑制蛋白质降解。在获得靶点信息后，为进一步验证靶标和活性分子之间的相互作用，该团队采用了生物膜干涉技术（BLI）和pull-down技术。靶标验证结果表明：DDO-7263与Rpn6具有显著的相互作用。综合所有研究结果表明：DDO-7263 通过与Rpn6蛋白结合阻断26S 蛋白酶体的组装和泛素化Nrf2的降解，从而激活Nrf2-ARE抗氧化通路。Rpn6的靶标鉴定为研究Nrf2抗氧化途径和蛋白质积累或降解的调控提供了新的分子机制。

图2. 基于小分子探针及蛋白质组的靶标垂钓过程。(A) 探针5、DDO-7263 和 D-生物素的结构。(B) 靶标垂钓实验示意图。(C) 靶标垂钓实验的SDS-PAGE分离和韦恩图分析结果。泳道1和泳道2分别代表链霉亲和素树脂和 D-生物素的非特异性结合。D-生物素作为阴性对照。泳道3和泳道 4显示蛋白质分别被200 和100 μM探针5的捕获情况。泳道5表明添加了100 μM DDO-7263作为竞争对照。(D&E) 125 种可能蛋白质的基因本体分析。

图3. DDO-7263作用机制示意图

该研究成果在线发表在Journal of Medicinal Chemistry 期刊上。中国药科大学的博士研究生代祯、硕士研究生安橹燕、博士研究生陈小意为本文共同第一作者，中国药科大学的徐莉莉副研究员、狄斌教授、尤启冬教授为本文的共同通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Target Fishing Reveals a Novel Mechanism of 1,2,4-Oxadiazole Derivatives Targeting Rpn6, a Subunit of 26S Proteasome

Zhen Dai, Lu-yan An, Xiao-yi Chen, Fan Yang, Ni Zhao, Cui-cui Li, Ren Ren, Bing-yan Li, Wei-yan Tao, Pei Li, Cheng Jiang, Fang Yan, Zheng-yu Jiang, Qi-dong You*, Bin Di*, and Li-li Xu*

J. Med. Chem., 2022, 65, 5029–5043, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c02210

导师介绍

狄斌

https://www.x-mol.com/university/faculty/82549 

尤启冬

https://www.x-mol.com/university/faculty/49905 

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