取血液、溃疡处液体或脑脊液进行化验

孕妇应接受梅毒筛查。此外，没有怀孕并且没有症状但梅毒感染风险增加的青少年和成人应接受梅毒筛查。

根据典型的下疳皮损，医生可初步诊断一期梅毒。硬下疳或出现在手掌和足底的典型皮疹常使医师怀疑梅毒。由于梅毒可以在各个阶段引起各种各样的症状，因此医生可能会在评估患者出现任何可能的症状（包括视力问题）时检查梅毒。

确诊有赖于实验室检查结果。有两种血液检查：

通常首先进行筛查试验，如性病研究实验室(VDRL)或快速血浆反应素(RPR)检测。这些检查被称为非密螺旋体检查，因为它们不直接检测导致梅毒（密螺旋体）的细菌或对这些细菌产生反应的抗体。初筛试验价格便宜且易做，不过在初始感染后的 3~6 周内，试验结果有可能为阴性，虽然患者此时已感染梅毒。这类结果称作假阴性结果。如果初筛试验的结果为阴性，但医生怀疑一期梅毒，则应在6周后复测。有时，患者并不存在梅毒，但患者的其它疾病可能会导致初筛试验结果为阳性（假阳性）。

初筛试验阳性结果必须经确证试验（第二种血液试验）以确诊。这些血液化验测量的是身体针对导致梅毒的细菌产生的特异性抗体（有时称为密螺旋体检测）。在初期感染后的几个星期内验证测试的结果也可能是假阴性，因此可能需要重复。

传统上，筛查试验首先完成，阳性结果通过确认（密螺旋体）试验证实。有时医生会先进行密螺旋体试验。如果结果为阳性，则进行快速血浆反应素试验（筛选试验）。

如果检测结果为阳性，医生可以询问患者以前的性伴侣、以前的化验结果以及以前的治疗方法，以帮助确定患者目前是否患有梅毒或是否曾患过梅毒。

当治疗取得成功后，初筛试验的结果会慢慢转阴（经数月到数年时间），但确诊试验的结果会永远保持阳性。

一期梅毒或二期梅毒也可使用暗视野显微镜确诊。从皮肤溃疡或淋巴结中取出液体样本，并使用专门配备的光学显微镜进行检查。黑暗的背景下显得明亮的细菌，使它们更容易识别。

在潜伏期，使用同样的血液检查（密螺旋体和非密螺旋体）来诊断梅毒。根据评估结果，医生还尝试确定该阶段是否为早期潜伏梅毒或晚期潜伏梅毒，包括全面的体格检查和对以前的测试结果的回顾。

在三期梅毒中，诊断依据症状和抗体检测结果。根据存在不同的症状，完成相应的测试。例如，胸部 X 线或其他成像检查可测出有无主动脉动脉瘤。

如果怀疑神经梅毒，无论梅毒的分期，需做脊椎穿刺（腰穿）采集脊髓液，以检测其中的细菌抗体。

梅毒患者还应接受其它性传播感染（包括 HIV 感染）的检测。