两种调控系统的总结对比：

（二） 应用方向

利用tet-on表达调控载体，包装成工具病毒，最后在实验中即可进行相应的基因操作，可直接感染细胞进行基因的诱导表达；也可注射动物，随后通过DOX的小鼠饲养调控工具病毒是否发挥作用。

体外-诱导型慢病毒使用-细胞实验-tet-on慢病毒

在未加入Dox的时候，目的基因也会有非常微弱的表达，这种表达强度随着Dox的增加而增加。

体内-诱导型慢病毒使用-裸鼠移植瘤模型-tet-on慢病毒[2]

• 动物选择：6周龄裸鼠

• 细胞选择：神经母细胞瘤SK-N-SH-FTH1细胞系（6E6cells/limb；100μl）

• 药物剂量：DOX饮水给药（2 mg/ml）

（三） 客户应用案例分析

客户应用文献1-应用方向（胃癌）[3]

（A）细胞系的建立：用Tet-E2F1病毒载体AGS和SGC7901细胞，并用Dox处理。RT-PCR检测miR-218和E2F1的表达；

（B） 启动子区的分析：显示核心有五个保守的E2F1结合位点SLIT2/miR-218的25个启动子区（SLIT2-1、SLIT2-2、SLIT2-3、SLIT2-4和SLIT2-5）和其核心启动子区的三个保守E2F1结合位点 SLIT3/miR-218（SLIT3-1、SLIT3-2、SLIT3-3）。

（C）WB检测： E2F1、SLIT2、，和SLIT3蛋白通过Western印迹法测定。

（D） 荧光素酶报告基因检测：AGS细胞与荧光素酶报告载体一起转染Tet E2F1载体含有指定的启动子区域，然后用Dox处理。相对的7转染48小时后测定荧光素酶活性。

（E）荧光素酶报告基因检测： AGS细胞转染Tet E2F1载体和荧光素酶报告载体包含指定的启动子区域或突变启动子区域，然后10用Dox治疗。转染48小时后测定荧光素酶的相对活性。

（F） 用Tet-E2F1载体转染AGS细胞，并用或不用Dox治疗24小时。芯片分析使用抗E2F1或IgG抗体。覆盖约5.0 kb区域的基因组DNA片段通过qPCR分析个周围SLIT2或SLIT3 TSS。

客户应用文献2-应用方向（神经母细胞瘤细胞）[4]

1. Dox控制的FTH1表达的示意图：

FTH1表达由四环素反应元件（TRE）控制:

• 在Dox给药的情况下，由泛素（Ubi）调节的反向四环素控制的反式激活子（rtTA），激活TRE并打开FTH1表达式。

• 在不给予Dox后，rtTA和FTH1表达均未激活TRE已“关闭”

1. Dox诱导FTH1表达的Western blot分析：

（A）Dox剂量依赖性FTH1表达：SK-N-SH-FTH1用不同浓度的Dox培养细胞。随着Dox浓度的增加，FTH1表达增加，在0.6μg/ml Dox；然而，FTH1的表达随着Dox浓度的升高而降低。

（B） 时间依赖性FTH1表达：SK-N-SH FTH1细胞在含有0.6μg/ml Dox的培养基中培养不同时间。FTH1表达在72小时达到高峰，然后随时间减少

3. Dox诱导的Flag表达的免疫荧光染色：

SK-N-SH-FTH1细胞在不同温度下培养72小时Dox浓度:

• flag特异性抗体的免疫染色显示flag表达（红色荧光）显著增加

• SK-N-SH-FTH1细胞在暴露于0.6μg/ml Dox 72小时后更强，与western blot结果一致。

• 细胞核用DAPI（蓝色）染色。

客户应用文献3-应用方向（骨髓基质干细胞BMSCs）[5]

Tet-on系统修饰骨髓基质干细胞BMSCs，有效控制BMP-2蛋白的释放，促进骨髓基质干细胞BMSCs的成骨分化

(A） 包含BMP-2基因修饰的BMSC的微囊与单独细胞（无微囊）的比较：

在第14天测定了Tet介导的BMP-2产生的最高诱导规模，在每个时间点，两组之间没有观察到任何显著差异。

（B）BMP-2在微囊包裹的基因转导或正常BMSCs上的表达：

在第1至5天通过1 lg/mL强力霉素诱导。显著差异与未经处理的细胞相比，每天在基因修饰的骨髓基质干细胞中检测到的细胞凋亡率，但当停止使用强力霉素时，细胞凋亡率降至基础水平。

（C） 停用强力霉素：

BMP-2的表达在第35天下降到背景水平。不添加强力霉素，BMP-2分泌为阴性。

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参考文献…

[1] Das T , Atze, Tenenbaum, et al. Tet-On Systems For Doxycycline-inducible Gene Expression[J]. Current Gene Therapy, 2016.

[2]He X , Cai J , Hao L , et al. In Vivo magnetic resonance imaging of xenografted tumors using FTH1 reporter gene expression controlled by a tet-on switch[J]. Oncotarget, 2016, 7(48):78591-78604.

[3] Min D , Chao Z , Lu X , et al. miR-218 suppresses gastric cancer cell cycle progression through the CDK6/Cyclin D1/E2F1 axis in a feedback loop[J]. Cancer Letters, 2017, 403:175-185.（吉凯客户文献）

[4] He X , Cai J , Li H , et al. In Vivo magnetic resonance imaging of xenografted tumors using FTH1 reporter gene expression controlled by a tet-on switch[J]. Oncotarget, 2016, 7(48):78591-78604.（吉凯客户文献）

[5] Du X , Huang F , Zhang S , et al. Carboxymethylcellulose with phenolic hydroxyl microcapsules enclosinggene-modified BMSCs for controlled BMP-2 release in vitro[J]. Artificial Cells, 2017:1-14.（吉凯客户文献）返回搜狐，查看更多