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《抗生素生产工艺学》笔记.docx 《《抗生素生产工艺学》笔记.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《《抗生素生产工艺学》笔记.docx(32页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。 《抗生素生产工艺学》笔记 《抗生素生产工艺学》笔记 《抗生素生产工艺学笔记》希望对大家有帮助 绪论 第一章抗生素概述 第一节抗生素是怎样的物质 一、抗生素定义 抗生素是生物在其生命活动过程中所产生的,或经其他方法(生物化学或半合成)衍生的。 在低浓度下,具有选择性地抑制或杀灭它种生物机能的一类化学物质。 如青霉素、氯霉素(也可合成)、氨苄青霉素(半合成品)等。 克霉唑: 至今还未发现哪种微生物可以合成。 所以不能算抗生素,只能算抗菌药。 二、抗生素的形成及其生物学意义 微生物量多,种多,分布广。 有共生,有拮抗,有自发突变,有诱发突变。 随着抗生素合成机理和微生物遗传学理论的深入研究,目前人们已经了解到抗生素有别于其他(初级)代谢产物。 抗生素是次级代谢产物。 次级代谢产物还有生长素(赤霉素),毒素(如黄曲霉素)。 这些产物与微生物的生长繁殖无明显的关系,是以基本代谢的中间产物如丙酮酸盐,乙酸盐等作为母体衍生出来的。 其结构性质随不同微生物种属而异,因此次级代谢产物很多。 基本代谢产物如蛋白质、脂肪、多糖等物质,直接与微生物的生长繁殖相关。 这些物质的构造也因微生物种属不同而异,但产生这些物质的代谢过程基本相似。 在某些放线菌中发现次级代谢产物与染色体外的遗传因子——质粒也有关系。 微生物生产抗生素的原理: 控制发酵条件,使抗生素产生菌的代谢向合成抗生素的方向发展,从而有利于抗生素的产生。 三、医用抗生素应具备的条件 1.“差异毒力”大; 2.不易产生耐药性; 3.副作用小(如不产生过敏反应); 4.具有较好的理化性能,便于提取、精制、贮藏; 5.在人体内应发挥其抗生效能,并不立即遭体内破坏。 6.给药(注射,口服等)后,很快吸收,并分布到被感染的器官或组织。 第二节抗生素发展史 相传2500多年前,我们的祖先就用长在豆腐上的霉菌治疗疥疮等疾病。 民间还有地方用发霉的面包,玉蜀黍等来治疗溃疡、肠道感染和化脓性感染等。 1928年Fleming在研究葡萄球菌变异时发现,污染在培养基上的霉菌抑制了细菌的生长。 -→点青霉-→青霉素-→难提取-→未引起重视-→1940年代弗洛里(Florey)和钱恩(Chain)重新研究弗来明工作-→1943~45年间,发展成了新的一个工业部门: 抗生素发酵工业。 在这期间,1944年Waksman发现了链霉素。 随后氯霉素、金霉素、制霉菌素等不断出现。 60年代半合成青霉素迅速发展。 70年代抗生素品种迅速发展。 50年代各国还致力于农抗的研究,找到了如杀稻瘟素、六瘟素、春日霉素、多氧霉素、有效霉素等。 到现在为止,抗生素品种非常多,有说3万、4万,也有说8万、9万的。 但在临床上应用的仅有120~350余种。 我国抗生素生产情况。 第三节抗生素的分类 从自然界获得的抗生素已达9000多种,微生物来源就有3000种以上,需进行分类。 一、根据微生物来源分类: 1.放线菌产生的抗生素; 2.真菌产生的抗生素; 3.细菌产生的抗生素; 4.动植物产生的抗生素。 二、根据抗生素的作用分类: 1.抗革兰氏阳性菌抗生素; 2.抗革兰氏阴性菌抗生素; 3.抗真菌类抗生素; 4.抗结合分枝杆菌类抗生素; 5.抗癌细胞类抗生素; 6.抗病毒和噬菌体类抗生素; 7.抗原虫类抗生素。 三、根据抗生素的作用机制分类: 1.抑制细胞壁合成的抗生素; 2.影响细胞膜功能的抗生素; 3.抑制核酸合成的抗生素; 4.抑制蛋白质合成的抗生素; 5.抑制生物能作用的抗生素。 四、根据生物合成途径分类: (一)氨基酸、肽类衍生物: (见书P6/1-5段) 1.简单氨基酸衍生物: 环丝氨酸、重氮丝氨酸等。 2.寡肽抗生素: 青霉素、头孢菌素等。 3.多肽类抗生素: 多粘菌素、杆菌肽等。 4.多肽大环内酯类: 放线菌素等。 5.含嘌呤和嘧啶基团的抗生素: 曲古霉素,嘌呤霉素等。 (二)糖类衍生物: 1.糖苷类抗生素; 2.与大环内酯连接的糖苷抗生素。 (三)以乙酸,丙酸为单位的衍生物。 1.乙酸衍生物: 四环类,灰黄霉素等。 2.丙酸衍生物: 红霉素等。 3.多烯和多炔类抗生素: 制霉菌素、曲古霉素等。 五、根据化学结构分类: 1.β-内酰氨类; 2.氨基糖苷类; 3.大环内酯类; 4.四环类; 5.多肽类: 多粘菌素、杆菌肽、放线菌素等; 6.多烯类: 制霉菌素、两性霉素B、球红霉素、曲古霉素等; 7.苯烃基胺类: 氯霉素、甲砜氯霉素等; 8.蒽环类: 罗红霉素、阿霉素、正定霉素; 9.环桥类: 利福霉素等; 10.其它类。 第四节抗生素的应用 一、抗生素剂量表示法 1.折算重量单位: 规定能抑制50ml标准肉汤的葡萄球菌为一个单位。 1u=0.6ug青霉素G.Na盐;1mg青霉素G.Na=1667u (1mg青霉素GNa可抑制83300ml肉汤中的葡萄球菌。 ) 2.重量单位: 以抗生素活性部分为一个单位: 如庆大霉素碱1mg=1000u. 3.类似重量单位: 以特定纯粹盐为重量单位: 如盐酸金霉素1mg=1000u. 4.特定单位: 制霉菌素1mg=3000u杆菌肽1mg=55u. 二、抗生素在医疗上的应用 三、抗生素在农业和畜牧业上的应用 第五节抗生素研究的范畴及趋向 一、生物学和生物化学方向的研究 1.新抗生素筛选 2.选育高产菌株 3.抗生素合成机理的研究 4.抗生素作用机理(机制) 二、化学方面的研究 1.抗生素化学性质与结构 2.抗生素结构改造 3.抗生素化学检定方法 4.抗生素生产、应用的劳动保护和三废处理 三、生化工程方面的研究 第六节抗生素工业生产概况 抗生素工业生产是生物工程和化学工程融合而成的新的学科。 1.特点: 纯种发酵、需氧发酵、次级代谢产物(无法从投料计算)、有效成份低,而且不稳定。 2.生产工艺过程: 菌种→孢子制备→种子→发酵→提取→精制→成品检验→包装→分装→(应用→跟踪→质量分析) 第一章思考题 1.抗生素的定义。 2.抗生素有哪几种分类法,各有什么特点,举例简要说明。 3.抗生素剂量表示法有哪几种,举例说明。 4.医用抗生素应具备的条件是什么? 5.抗生素工业生产有什么特点? 6.抗生素一般生产过程如何? hgx5182003-10-1711: 52 Re: 《抗生素生产工艺学笔记》希望对大家有帮助 第一部分抗生素生产工艺 第二章菌种选育及菌种保藏 第一节菌种选育的理论基础 一、微生物的遗传和变异 遗传与变异是自然现象,又是客观规律。 点突变 基因突变 遗传(型)变异: 遗传物质决定(DNA或RNA)染色体畸变 变异基因重组 表型变异: 环境因素 二、基因突变 基因突变类型 三、基因重组(generecombination) 指两个或多个不同性状个体的遗传基因转移到一个体细胞内,经重新组合后,造成菌种变异,形成新的遗传型个体。 基因重组 第二节菌种选育的经典方法 一、经典法 二、诱变剂 1.物理诱变剂 2.化学诱变剂(参见书P27及《工业微生物育种》) 3.生物诱变剂: 温和噬菌体 第三节现代菌种选育技术 一、杂交育种: 指两个基因型不同的菌株通过接合使遗传物质重新组合,再从中分离,筛选出具有新性状的菌株。 一般包括以下过程: 标记菌株的选择→异核体的形成→杂合二倍体的形成→重组体的转化→重组体遗传性状的分析 二、原生质体融合 亲本A→标记→原生质体A 混合→原生质体融合→融合子捡出→融合子分析 亲本B→标记→原生质体B 三、基因工程 1.目的基因的准备 2.载体系统 3.基因与载体连接 4.转化 5.重组体的筛选和表达产物的鉴定 四、新抗生素产生菌的获得 1.传统: 土壤中放线菌、真菌、细菌。 2.趋势: 稀有放线菌,海洋微生物,极端环境微生物,人工改造获得微生物。 第四节菌种保藏 1.定期移植保存法 2.液体石蜡封藏法 3.真空冷冻干燥保藏法 4.液氮超低温保藏法 5.沙土管保藏法 6.麦皮保藏法 第三章培养基 第一节培养基成分及其功能 一、碳源: 提供微生物生长繁殖所需的能源和构成细胞的碳骨架。 1.碳水化合物: 单糖,多糖,多聚糖(为葡萄糖,蔗糖,淀粉等) 2.脂肪 3.有机酸(CH3COONa+2O2→2CO2+H2O+NaOH) 二、氮源: 构成菌体细胞物质,提供N原素 1.无机氮源: 如NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、(NH4)3PO3等(快速利用N源)。 2.有机氮源: 花生饼粉,黄豆饼粉,玉米浆,玉米;白粉,蛋白胨,酵母膏(慢速利用氮源)。 酵母膏→B因子→使阻断菌恢复产生抗生菌(利福霉素)的能力 (NH4)2SO3→2NH3+H2SO3 NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH 三、无机盐、微量元素: P、S、Mg、Fe、K、Na、Cu、Zn、Mn等。 四、水: ①构成生物体的成分;②培养基的组成部分;③参与代谢反应; ④作为代谢反应介质;⑤作为物质传递介质;⑥良好的热导体。 五、生长因子及其主要功能 生长因子: 维生素,氨基酸,嘌呤和嘧啶等。 1.维生素: 是辅酶的组成成分; 2.氨基酸: 有些生物不能合成某种氨基酸; 3.嘌呤和嘧啶: 构成核酸和辅酶。 六、前体及其主要功能 能被微生物直接利用,以构成次级代谢产物结构的一部分,而其本身结构没有大的变化,这种物质称为前体。 如: 苯乙酸及其类似物是青霉素G的前体;苯氧乙酸是青霉素V的前体;氯化物(NaCl)是金霉素的前体;肌醇是链霉素的前体;正丙醇,丙酸是红霉素的前体等。 前体虽然能大大提高次级代谢产物的产量,但往往对菌体有毒性,在应用时应特别注意。 七、诱导物或刺激剂: 能诱导或刺激某种物质的产生或大大提高其产量的物质。 如: β-吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物;甲硫氨酸和亮氨酸是头孢菌素的刺激剂; 丙氨酸和异亮氨酸是阿弗米丁的刺激剂;巴比妥是链霉素、利福霉素等的刺激剂; B因子(3‘―磷酸丁酰―腺苷)能刺激利福霉素产生菌生产能力成倍增长。 八、抑制剂及其主要功能 在次级代谢产物发酵生产过程中,往往抑制某一代谢途径,就会使另一代谢途径活跃。 如溴化物抑制了金霉素的产生,从而减少金霉素的含量,提高四环素的含量;加入二乙基巴比妥盐可抑制利福霉素B以外其他利福霉素的生成,从而增加利福霉素B的含量和产量。 第二节培养基的种类 一、按来源分类: 二、按状态分类: 三、按用途分类: 第三节影响培养基质量的因素 一、原材料质量的影响: 玉米浆、黄豆粉、花生饼粉、蛋白胨、淀粉、糊精、CaCO3等因品种、产地、加工方法、储藏条件等的不同均有可能造成质量上出现较大的波动。 二、水质的影响 深井水、地表水、自来水、蒸馏水等的水质有极大的不同。 它们随地质(地区)(地貌)、季节、处理方法和环境的变化而变化。 自来水是发酵工业的主要用水,而自来水厂水质处理所用的漂白粉、沉淀剂、消毒剂等往往造成水质的较大波动。 三、灭菌操作 葡萄糖与含氨基的物质反应形成→5-羟甲基糖醛和棕色的类黑精(焦化)对微生物有一定的毒性。 磷酸盐与Ca2+、Mg2+、NH4+等反应形成沉淀或络合物。 四、培养基粘度的影响 粘度是培养基物性的重要指标之一,它直接影响氧的传递、营养成分、无机盐、生长因子等的扩散,从而影响细胞的呼吸、营养成分的吸收,最终导致影响目标产物的形成。 第四节培养基配置的原则 一、碳氮源种类的确定原则 快速利用碳氮源、慢速利用碳氮源的种类配比要满足不同微生物,不同生长阶段和生产阶段的需要。 二、碳氮源比例的确定原则 斜面便于长孢子,种子利于长菌丝;发酵前期利于长菌丝,中后期利于合成和积累目标产物。 此外C/N比等应与环境因素结合考虑,为对溶氧条件较好的设备,对通气较足的配置可采用菌丝较浓的C/N比。 对溶氧较差、通气不足的设备可采用菌丝较稀的C/N比。 三、培养基配置与pH之关系原则 酸性抗生素发酵环境一般呈酸性(低于pH7),中性及碱性抗生素发酵环境一般呈中碱性(pH>=7)。 因此在配置培养基时,生理酸碱性原料应合理搭配。 四、保证源副材料质量的稳定性原则 定点采购、定点加工、稳定加工工艺、恒定的贮存条件、再配合预试验来保证大工艺的稳定。 hgx5182003-10-1711: 54 Re: 《抗生素生产工艺学笔记》希望对大家有帮助 第四章灭菌及染菌防治 第一节对数残留定律 一、对数残留定律 湿热灭菌时,培养基中微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比: 式中: N—菌的残留个数 —为灭菌时间(秒) k—为速率常数(1/秒) Ns一般取0.001(即1000次灭菌有一次失败的机会) 如N0=2×107个/ml时,60m3罐装40m3料,求 121℃时,k取0.027(1/秒) 二、培养基灭菌温度的选择 培养基破坏为热分解反应,属于一级反应动力学; 式中: C为反应物浓度(克分子/升) 为反应时间(秒) k’为化学反应速率常数(1/秒)(随温度及反应种类而变) 在化学反应中,其他条件不变,则反应速率常数和温度的关系可用阿累尼马斯方程式表示: 培养基: R=1.987卡/°k? 克分子(气体常数) 灭菌速率常数: 式中: E’=卡/克分子(活化能) T=绝对温度°K 或R=8.313J/mol? k △E’=J/mol T=绝对温度°K A为比例常数 灭菌时: (K1为温度T1时的灭菌速率常数) (K2为温度T2时的灭菌速率常数) 以上两式相除: ;————————① 同时培养基破坏也可得出: ————————② ①除以②得: ∵灭菌活化能E大于培养基成分破坏的活化能E’,即E>E’ ∴大于 即随着温度的上升,灭菌时速率常数的增加倍速大于培养基破坏的速率常数增加的倍速。 因此有认为高温灭菌优于低温灭菌之说。 一般E’≈2,000~20,000(卡/克分子) E≈50,000~100,000(卡/克分子) 注: 枯草杆菌FS5230的k≈0.047~0.063s-1; 梭状芽孢杆菌PA3679的k≈0.03s-1; 嗜热脂肪芽孢杆菌FS1518的k≈0.013s-1 嗜热脂肪芽孢杆菌FS617的k≈0.048s-1 第二节发酵设备灭菌 一、实罐灭菌: 1.预热(80~90℃) 2.直热(蒸汽)(120℃、30min)(全进全出原则) 3.待空气压力高于罐内压力时,通入空气。 (即待罐内压力降到低于空气压力后导入无菌空气。 ) 二、空罐灭菌: 130℃,45~60min,直接蒸汽法。 冷却系统水应排净(夹套与盘管)。 三、连续灭菌: 配料(预热)→连消塔→维持罐→冷却管→无菌培养基。 四、空气过滤除菌 五、发酵染菌的原因分析及防治措施 1.渗漏; 2.空气系统; 3.输料(物料)系统(种子带菌、补料带菌); 4.灭菌系统(料结快导致消不透等); 5.操作系统(倒压、死角等)。 第五章发酵过程控制 一、碳源浓度变化及其控制 1.一般控制法: 决定补糖的参考参数有: 糖的消耗速率、pH变化、菌体浓度、菌丝形态、发酵液粘度、溶解氧浓度、消沫油使用情况、罐内发酵液实际体积等。 补糖方式: 连续滴加、少量多次、大量少次等。 2.动力学模型控制法: 需建立动力学模型,在实际生产上应用较少(略)。 二、氮源浓度变化及其控制 对每一种微生物,其生长期和生产期均有较合适的氮浓度要求。 控制氮源浓度一般以氮基氨作为指标。 但确定最佳氮浓度几乎是不可能的,因为即使是同一菌种,不同批次、不同时间,均有不同的最佳点。 生物发酵绝对的重复性难以获得,因此也就不存在最佳氮浓度。 但工艺控制的目的是使氮源等趋于最佳化。 趋于最佳化是工艺技术追求的目标,是永恒的主题,也是难题。 较合理的氮浓度是在实际中采集,而不是人为创造的。 从最好的生产批号中不断分析总结出合理的氮源浓度,然后人为创造条件,以满足生产的需要。 补充氮源分为补充方式与补碳源类似,以达到最佳生产为目标。 三、补无机盐、前体 补无机盐,一般以磷酸盐、硫酸盐、铵盐等较常见,CaCO3也是发酵中常用的盐,但单一补充CaCO3的较少。 无机盐有生理酸碱性之分,不仅可以作为微量元素,又可作为C、N源,还可以调节pH,改善发酵环境,是一个非常灵活的发酵中间调控物质,赋予了发酵工艺(程)的深刻奥秘,应在实际工作中灵活应用。 前体能大大提高发酵水平,但前体一般对生长不利,应把握补加的时间和数量,特别是浓度的控制,否则将适得其反。 四、溶氧浓度的变化和控制 1.溶氧浓度变化规律 D0 t 2.(发酵异常时)溶氧变化 ①染好气性杂菌 ②染噬菌体 ③呼吸减弱 ④菌丝自溶 ⑤设备故障(加油失灵、空气过滤器堵塞等) 3.溶氧控制 ①加大通气量 ②适当降低温度 ③提高压力 ④补水 ⑤条件许可情况: 提高搅拌转速,特别是实验小罐。 思考: 以上哪一种方法最好? 补水最好。 五、温度控制 温度控制的选择: 一般来说,生长温度与生产温度控制有所差别。 不同温度将引起向不同的生物合成方向发展。 因此,在发酵工艺控制上对温度的掌握也要引起注意。 通常情况下,在不影响生物合成方向改变的情况下,高温有利于生长,低温有利于生产,但并不绝对。 六、pH控制 应知道: 无机酸碱调节pH最方便、省事,但也是最无奈的办法。 生理酸碱性物质调节pH最困难,不易把握,但只要对症,效果最佳。 七、泡沫控制 泡沫大都是由蛋白质等易起泡的成份所引起。 正常起泡: 1.前期: 由于营养成份丰富而起泡,这类泡沫只要菌丝迅速生长,泡沫自然消除。 2.末期: 细胞自溶而起泡,预示着应尽快放罐。 异常泡沫: 1.前期长时间泡沫不能下降,说明菌体可能不能正常生长,应在促进生长上解决问题,若在消泡上下功夫,将导致更不好的后果,这种情况下,应以人工消泡为主。 2.中期起泡,预示着异常发酵的出现,处理方法将视具体情况而定。 消沫剂在发酵工程是不可缺少的控制剂,但应越少越好,不可盲目使用,否则,其作用是相反的。 八、发酵终点的判断 1.单位不长; 2.NH2-N回升; 3.C点较低; 4.泡沫回升; 5.菌丝出现空泡、衰老。 九、发酵异常处理 1.发酵液较稀: (染噬菌体除外)菌丝溶解快于生长,可补天然丰富氮源,减少油、消泡剂、前体等的补加。 (补种) 2.发酵液过浓: 补水(同时要注意渗透压等变化对生长和生产的影响)。 3.糖耗过慢: 补P,补N源,升温,补种等。 4.pH异常: 污染、补生理酸碱性物质。 hgx5182003-10-1712: 03 Re: 《抗生素生产工艺学笔记》希望对大家有帮助 第二部分抗生素 第七章β-内酰胺类抗生素 第一节β-内酰胺类抗生素概述 一、特性 二、命名 青核→青霉烷酸→6-氨基青霉烷酸→青霉素G(苄青霉素)→Na盐、K盐 头核→头孢霉烷酸→7-氨基头孢霉烷酸→头孢菌素C 三、物理性质 β-内酰胺环: 伸缩震动频率,由振动频率分析其结构稳定性。 头孢菌素C在260nm处有一吸收峰。 (特征) 立体结构 β-内酰胺环的反应性能。 (归理化性质讲) 第二节青霉素理化性质 旋光性: pK值2.76(25℃),可与NEP(N-乙基六氢吡啶)成盐而从溶媒中析出。 (可算特征反应,但青霉素X除外。 ) 青霉素族抗生素: 加工成普鲁卡因青霉素或苄星青霉素(二苄基乙二胺,长效)。 单位表示法: 1667μ/mg(理论值),1μ=0.5999...(0.6)ug. 一、稳定性 1.稳定: 纯净干品相当稳定,150℃1.5hr效率不降。 青G、Na、K、普,有效期三年。 pH=6~6.5最稳定(以5~7为好);在非极性溶媒中稳定;在缓冲力强溶液中稳定。 2.不稳定: 归降解反应讲。 (过酸过碱、热等均不稳定。 ) 二、溶解度 1.青霉素盐在极性溶剂中溶解度大。 (水中>20mg/ml) 2.青霉素游离酸在非极性溶剂中溶解度大。 若非极性溶媒含水量上升,青霉素碱金属盐溶解度大大上升。 三、紫外光谱 青G: 在252、257、264nm处有弱吸收峰,是侧链苯乙酰胺基引起的。 是杂质,因此优级品规定在处不得高于0.05。 四、降解反应 1.在β-内酰胺酶及碱性作用下→青霉噻唑酸 2.在酸(性)作用下→β-内酰胺环破裂 青霉烯酸青霉酸→异青霉酸 (噁唑酮: 320nm) (COOH) 3.酸性水解的最终产物: SRCONHCH2CHO青霉醛(酸) RCONH+2H2O+ NCOOHH+/100℃(CH3)CSHCHCOOH青霉胺 ONH2 + CO2 4.高度真空下,分子重排形成青霉咪唑酸: S RCONHCHCHS RCONC NCOOH OCH2NCOOH C===O 青霉咪唑酸 5.青霉素酰胺酶(大肠杆菌产生)—→6-氨基青霉烷酸。 重要的半合成中间体。 RCONH-CHCOOH(α-酰胺基丙二酸) 6.碱性水解生成青霉噻唑酸—→→青霉胺酸COOH 7.青霉素与羟胺(NH2OH)—→氧肟酸—→铁盐紫色复合物 SSS RCONHNH2OHRCONHRCONH NCOOHONHCOOHNHCOOH ONHOHONHC Fe3+O 紫色复合物 五、过敏反应(放概述中讲) 综合以上的反应特性。 测定青霉素的方法有: 1.碘量法; 2.比色法: 与羟胺反应生成氧肟酸进而与高价Fe3+形成紫色复合物; 3.光密度法; 4.生物法; 5.HPLC法等。 第三节青霉素生产(菌种与发酵) 一、菌种: 选育得到高产株。 孢子颜色特征: 黄绿、绿、蓝绿 产黄青霉 国内: 大多数生产厂都采用绿孢子丝状菌。 细胞生长发育: 分为6期: Ⅰ-Ⅲ长菌丝为主; Ⅲ-Ⅴ产单位为主; Ⅵ放罐。 (NH4)2SO4→2NH3+2H++SO42-(NH4)2HPO4→2NH3+H |
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