第三步

预测完启动子序列后还不够，需要通过实验筛选出具有活性、片段最短特异性启动子：

首先，构建不同长度的启动子（通常取-5k或者-3k至ATG这一段）；

其次，根据第二步分析的同源性情况进行启动子截短，将众多的调控序列包含在不同的截短体中；

最后，在目的以及非目的细胞中验证不同截短体启动子的表达情况，即可筛选出较短并具有特异性表达活性的启动子序列。

这篇文章在主动脉内皮细胞BAEC与非内皮细胞COS中检测了不同长度ICAM-2启动子的表达情况，证明了0.33kbp启动子在体内和体外都具有高特异性，并且在5’区域上游增加到2.7kb并不会增加其表达活性。

不同长度启动子的活性对比

BAEC：主动脉内皮细胞；COS：非内皮细胞

第四步

筛选特异性调控因子，成为验证特异性启动子的必经之路。

特异性调控因子的筛选方法常采用“对预测的转录因子进行单点或者组合突变”的手段。

这篇文章采用突变和凝胶电泳迁移证明了ICAM-2启动子中的Sp1位点和2个GATA位点是顺式作用的正调节因子。Sp1位点的突变中止了主动脉内皮细胞BAEC中核蛋白的特异性结合，在BAEC细胞中ICAM-2的活性减少了70%。同时P8的突变也使ICAM-2的活性减少了70%。

点突变鉴定核心调控因子

通过以上4步，一个内皮细胞特异性启动子就出炉啦，还能发一篇启动子筛选和验证的文章。是不是很easy？不就是将筛选的特异性表达基因做启动子截断以及验证嘛，有啥难的！如果这样想，就是too young,too simple了。为什么这么说呢？

上篇文章中的特异性启动子调控位点恰好是在临近启动子的区域，但是新的研究发现：在人21和22号染色体上，只有22%的转录因子结合位点分布在蛋白编码基因的5'端；也就是说，还存在调控位点远离启动子的情况。比如巢蛋白(Nestin)是成年神经干细胞特异性表达蛋白，其特异性的表达就由2号内含子与启动子共同调控。

那么怎么做呢？

以下小编列举几篇关于Nestin研究思路的文章，以供参考【2】【3】

一、还是比对同源性

文章发现大鼠和人巢蛋白2号内含子的3'端部分含有高序列相似性的结构域，但启动子区域却不具有同源性。于是研究人员在SV40启动子前添加了不同长度的内含子序列，通过检测启动子活性的改变，证明2号内含子可以在Nestin阳性细胞（P19/F9）中增强启动子表达活性：

内含子驱动的启动子在Nestin阳性细胞（P19/F9）与阴性细胞中的表达活性

二、通过位点突变筛选特异性调控因子验证机制

第一步的实验显示出最短调控区段为2号内含子中的320bp，于是分析这段序列，找到了POU factor binding site（以TFBIND预测），并且做了点突变，验证了其为主调控因子：

三、序列拼接

在筛出位于内含子的最短调控序列后，将其置于核心启动子（多为TSS上游300-500bp）上游，整合后的序列即为特异性启动子。

以上文章重点论述的是内含子调控功能，也可以参考以下文章直接以不同长度的内含子加不同长度的启动子拼接验证【4】：

构建不同组合形式报告系统

P1:CMV启动子

P2:400bp核心启动子

P3:内含子2+核心启动子

P4:内含子+CMV启动子

P5:4kb启动子

P6:内含子+4kb启动子

将上述质粒转染至MEF细胞， P3与P6结果一致，所以认定内含子2+Nestin核心启动子的组合为最短特异性启动子。

不同组合质粒的荧光表达情况

除了单内含子调控的Nestin之外，还有双内含子调控的视网膜双极细胞特异性启动子Opto-mGluR6【4】；也有部分文章构建来自不同基因区段组合的启动子，如巨细胞特异性启动子SP146-C1【5】。这些不按套路出牌的特异性启动子简直是在为广大科研工作者挖坑！因此，小编强烈建议大家在自己的课题研究中尽量通过查找文献，使用已经前人验证的特异性启动子，而不是自己亲自动手去筛选。

近几年火热的腺相关病毒（AAV），通过特定血清型与特异性启动子的组合，可实现基因的定向递送，已经成为动物模型基础研究的常用载体系统，以及临床试验中基因治疗的热门选择。

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注 意

特异性启动子是可以跨物种使用的哦，原因嘛就在于功能性调控序列在物种间是保守的，所以不必纠结于启动子来源的物种类型。

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参考文献：

【1】The Human ICAM-2 Promoter is Endothelial Cell-specific in Vitro and in Vivo and Contains Critical Sp1 and GATA Binding Sites

【2】An Evolutionarily Conserved Region in the Second lntron of the Human Nestin Gene Directs Gene Exmession to CNS Progenitor Cells and to Early Neural Ciest Cells

【3】Second Intron of Mouse Nestin Gene Directs its Expression in Pluripotent EmbryonicCarcinoma Cells through POU Factor Binding Site

【4】AAV-Mediated Transduction and Targeting of Retinal Bipolar Cells with Improved mGluR6 Promoters in Rodents and Primates

【5】A macrophage-specific synthetic promoter for therapeutic application of adiponectin返回搜狐，查看更多