同位素标记方法：碘标记/生物合成法标记/生物素标记/其他标记技术

同位素标记

必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。正常情况下应包括避免物理的接触和对γ-射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废料。

1、碘标记

用碘标记抗体是一种有效的标记方法。125I衰变产生低能的γ和Χ射线，很容易被检测出来，而其60天的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。较常用的碘标记方法是氯胺T法，即将氧化剂氯胺T加入到抗体和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I转化成I2，游离I2可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。其主要操作步骤如下：

（1）在进行标记之前，先选用截流分子量为20000-50000的凝胶，制备1ml凝胶柱，然后分别用10倍体积的1%BSA/PBS /0.02%叠氮钠和PBS洗涤柱体，封住柱下口，备用。

（2）加入10ug纯化单抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸钠（PH7.5）的1.5ml指形管内。随后，加入500uCi Na125I混匀。

（3）加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室温放置60秒。再加入50ul氯胺T终止液（含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS）。

（4）将上述碘标记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱体下口，用1.5ml指形管收集。当碘标记物全部进入柱体，加入0.3ml含0.03%叠氮钠的 PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集0.3ml，重复进行，同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。标记抗体大约在第二至第四管出现。无害化处理柱子和非单抗标记部分。

（5）将标记单抗保存于4℃可使用6周时间。

2、生物合成法标记

将杂交瘤细胞培养在含有放射性前体的培养基中，随着抗体分子的合成、组装，同位素会标记在抗体分子的初级氨基酸链上，本方法不会导致抗体活性的丧失。其主要步骤是：

（1）离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，约需2×106个细胞。以预热37℃不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。

（2）用含2% PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至106个/ml，加入35S甲硫氨酸（每次加入100uCi可产生105-106cpm的抗体）。

（3）经C02培养箱中培养过夜，离心后，吸出培养上清，分别加入1/20体积的1mol/L Tris（PH8.0）及叠氮钠至浓度0.02%。该标记抗体可按纯化单抗方法进行。

四、生物素标记

生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。其主要步骤是：

1、用二甲基亚砜配制10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素（应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯）。

2、用硼酸钠缓冲液（0.1mol/L，PH8.0）稀释单抗溶液至1-3mg/ml。

3、每毫克抗体加入25-250ug的生物素酯，混匀后，室温作用4小时。

4、按每250ug生物素酯加入20ul 1mol/L NH4Cl终止反应，室温放置10分钟。

5、以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。

五、其他标记技术

适用于蛋白质的其他标记方法也可用于单抗，如金标记、化学发光标记、SPA标记、铁蛋白标记等。

99mtc/锝99m放射同位素标记溶菌酶

99mtc/锝99m放射同位素标记海藻酸钠

99mtc/锝99m放射同位素标记壳聚糖

99mtc/锝99m放射同位素标记半乳糖

99mtc/锝99m放射同位素标记甘露糖

99mtc/锝99m放射同位素标记葡萄糖

99mtc/锝99m放射同位素标记乳糖基

99mtc/锝99m放射同位素标记黄原胶

99mtc/锝99m放射同位素标记岩藻多糖

99mtc/锝99m放射同位素标记木聚糖

99mtc/锝99m放射同位素标记纤维二糖

99mtc/锝99m放射同位素标记香菇多糖

99mtc/锝99m放射同位素标记硫酸软骨素

99mtc/锝99m放射同位素标记辣根过氧化氢酶

99mtc/锝99m放射同位素标记药物或小分子

99mtc/锝99m放射同位素标记甲氨蝶呤

99mtc/锝99m放射同位素标记紫杉醇

99mtc/锝99m放射同位素标记阿霉素

99mtc/锝99m放射同位素标记顺铂

99mtc/锝99m放射同位素标记环丙沙星

99mtc/锝99m放射同位素标记甲硝唑

99mtc/锝99m放射同位素标记雷替曲塞

99mtc/锝99m放射同位素标记培美曲塞

99mtc/锝99m放射同位素标记磺胺地索辛

99mtc/锝99m放射同位素标记茴香酰胺

99mtc/锝99m放射同位素标记雌性激素

99mtc/锝99m放射同位素标记金刚烷

99mtc/锝99m放射同位素标记阿奇霉素

99mtc/锝99m放射同位素标记氮川三乙酸-镍

99mtc/锝99m放射同位素标记多肽RGD

99mtc/锝99m放射同位素标记cRGD

99mtc/锝99m放射同位素标记Angiopep

99mtc/锝99m放射同位素标记TAT

99mtc/锝99m放射同位素标记Octreotide

99mtc/锝99m放射同位素标记SP94

99mtc/锝99m放射同位素标记CPP

99mtc/锝99m放射同位素标记CTT2

99mtc/锝99m放射同位素标记CCK8

99mtc/锝99m放射同位素标记GEII

99mtc/锝99m放射同位素标记RVG29

99mtc/锝99m放射同位素标记YIGSR

99mtc/锝99m放射同位素标记WSW ( WSWGPYSC)

99mtc/锝99m放射同位素标记Pep-1 (CGEMGWVRC)

99mtc/锝99m放射同位素标记RVG29MMPs(GGGGCTTHWGFTLC)

wyf 04.16